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肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）是小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属的重要成员，主要感染5岁以下儿童，是导致手足口病（Hand-Foot-Mouse）的主要病原体，广泛流行于亚洲太平洋地区。该病毒可引起类似于脊髓灰质炎的神经系统症状，是一种重要的新发嗜神经病毒。目前临床上并无针对EV71病毒的有效疫苗和特效药物，疫苗是控制EV71感染的有效手段，许多疫苗候选株包括甲醛灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒疫苗、DNA疫苗以及亚单位疫苗都已取得了很好的实验结果，但是缺乏有效的临床试验数据。EV71病毒为单股正链RNA病毒，长度约7500bp，包含单一开放阅读框（ORF），ORF首先编码一个多聚蛋白,然后多聚蛋白被切割成VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白和若干个非结构蛋白。在病毒的结构蛋白中，VP1、VP2和VP3暴露于病毒颗粒表面，诱导机体产生免疫应答，决定了病毒的免疫原性，而VP4则完全位于病毒粒子的内部，与病毒的复制翻译有关。目前，许多EV71的线性中和表位已经确定，我们利用软件分析和序列比对筛选出在EV71不同基因亚型之间具有高度保守性的三个表位，它们分别是VP1蛋白上的SP55(氨基酸位置163-177)和SP70（氨基酸位置208-222）以及VP2蛋白上的SP28（氨基酸位置136-150），实验证明它们均可诱导小鼠产生针对EV71病毒的特异性中和抗体，是多表位疫苗的理想靶标。在本研究中，我们首先构建了EV71多个串联线性中和表位（SP55-SP70-SP28）的原核表达载体，随后对其进行诱导表达，获得了EV71多表位串联重组蛋白mTLNE。将纯化后的mTLNE免疫小鼠，从体液和细胞免疫两个方面，系统评价mTLNE的免疫效果，并进一步观察免疫血清对小鼠的体内保护效果，明确了mTLNE作为疫苗的可行性。1. EV71串联线性中和表位mTLNE的设计与构建；我们首先对EV71B细胞表位的保守性进行分析，选择SP55、SP70和SP28三个线性中和表位为靶标，再基于EV71国内流行株AH08/06（GenBank：HQ611148）上三个线性中和表位的的基因序列以及pET32a上的限制性酶切位点设计引物，为使三个表位能够独立的展示各自的抗原表位，在各表位之间插入蛋白Linker序列-（G4S）3。为同时表达上述三个表位，我们利用重叠PCR技术扩增三个串联表位的基因序列，然后将该PCR产物克隆到pET32a载体中，构建包含mTLNE基因的重组质粒，最后对重组质粒进行核酸序列测定。结果表明成功构建了包含mTLNE基因的原核表达载体。2．重组蛋白的表达、纯化和鉴定；将重组质粒转化BL21感受态细胞，用IPTG诱导表达，采用SDS-PAGE的方法进行鉴定，结果显示：重组质粒转化菌经IPTG诱导后在30KD附近出现了一条带，与预期大小一致，说明重组质粒可在原核细胞中表达目的蛋白。随后又对诱导菌进行超声破碎处理，同样采用SDS-PAGE鉴定，结果显示：预期大小的条带主要出现在诱导菌的上清中，证明mTLNE为可溶性蛋白。随后对mTLNE蛋白进行大量表达，用可溶性蛋白试剂盒纯化回收，并用SDS-PAGE、Western Blotting、ELISA等方法鉴定纯化的蛋白，结果表明：获得了mTLNE蛋白，其纯度大于99%，并且mTLNE蛋白可与EV71病毒免疫的鼠血清和兔血清反应，说明重组蛋白mTLNE具有良好的抗原性。3：重组蛋白mTLNE的免疫原性与免疫保护性分析；将mTLNE蛋白免疫6周龄的BABL/c雌鼠(Trx蛋白为阴性对照)，每隔两周加强免疫一次，共免疫三次。采用ELISA的方法测定免疫血清的IgG效价及亚型，结果显示：mTLNE初次免疫后即能够诱导小鼠体内产生EV71病毒特异性的IgG抗体，且随着免疫的加强，IgG效价逐渐升高，第二次加强免疫之后，IgG效价可以达到1:3191，lgG分型显示mTLNE诱导小鼠产生的lgG亚型主要为IgG1。采用TCID50的方法进行中和滴度的测定，结果显示第二次加强免疫后，免疫血清的中和抗体效价可以达到1:50。采用ELISPOT的方法对脾细胞分泌的细胞因子进行测定。结果显示mTLNE免疫小鼠后诱导其体内产生的细胞因子以IL-4和IL-6为主。随后又测定了免疫血清对1日龄BALB/c乳鼠的体内保护效果。结果显示：注射mTLNE免疫血清的小鼠全部存活且没有发病症状，而注射Trx免疫血清和PBS的小鼠在第5天开始发病，10天之内全部死亡，说明mTLNE的免疫血清可以有效的保护新生乳鼠免受EV71病毒的攻击。本研究表明，在原核细胞中表达的EV71串联多表位疫苗mTLNE，可有效诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答，而且免疫血清能够被动保护乳鼠免受致死剂量的EV71攻击。表明该疫苗可作为一种潜在的EV71疫苗候选株，以上结果为研制EV71新型疫苗提供了新思路。