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目的:手足口病是多发于婴幼儿的传染病,在亚太地区广泛流行并出现过多次暴发,但目前临床治疗方案仍以广谱抗病毒为主,暂无针对性治疗手段,且除EV71外其他型别尚无已批准上市的疫苗。在可引起手足口病的多种肠道病毒中以EV71和CA16为最主要病原体,但近年来部分非EV71和非CA16的肠道病毒感染导致手足口病的发病率呈上升趋势,如EVC96等。EVC96属于肠道病毒C组,其感染可导致手足口病、急性弛缓性麻痹、急性无力脊髓炎、急性出血性结膜炎等多种疾病,在国内外多个地区均有相关病例报道,具有危害公共安全的潜在风险。本研究对EVC96的分子特征进行分析,探究其在我国大陆地区的流行规律及变异趋势,为我国新现肠道病毒感染的预警、诊疗提供基础数据;并对其B细胞线性表位进行了预测、筛选,为EVC96诊断方法的建立和表位疫苗的研发奠定基础。方法:1.获取EVC96基因组全长序列及VP1区序列,除来自广东省疾病预防控制中心的EVC96分离株A240及课题组测序得到的P86外均来自GenBank。利用MEGA7.0构建进化树,DNAMAN分析同源性,Simplot3.5.1及RDP4.9软件进行重组分析,探究我国大陆地区EVC96分离株的进化趋势。2.利用4种算法不同的B细胞表位在线预测服务器对EVC96代表株的VP1、VP2及VP3区进行预测,并通过进一步综合二级结构、三级结构的预测结果,对EVC96的B细胞线性表位进行筛选。3.人工合成EVC96的候选B细胞表位多肽,液质联用法(HPLCMS)检测纯度,间接ELISA法测定反应性。4.将EVC96 B细胞表位多肽与常见手足口病常见病原体多克隆抗体进行交叉反应,同时将其与KLH偶联后免疫家兔获得表位多肽多克隆抗体并与常见手足口病病原体抗原进行交叉反应。并将表位多肽序列进行型内、型间的保守性分析。结果:1.对世界范围内的EVC96基因组全长、VP1全长、部分VP1序列分别进行分子特征分析并构建VP1区系统发育进化树,可分为Cluster 1~3共三个基因簇,且所有中国分离株均属Cluster 3。Cluster3与Cluster 2之间的遗传距离为0.258,与Cluster 1之间的遗传距离为0.241;Cluster 2与Cluster 1之间的遗传距离为0.261;Cluster 3组内遗传距离为0.187,Cluster 2组内遗传距离为0.242,Cluster 1组内遗传距离为0.036。根据全长VP1序列对EVC96中国分离株进行分子分型可分为6个基因型,根据部分VP1序列则可分为8个基因型。2.根据基因特征分析选择EVC96中国代表株A240进行分析。Simplot分析EVC96分离株A240在P1区与EVC96原型株BAN00-10488的相似性较高;在2B区、2C区及3C区与CA24原型株Joseph相似度最高;在3D区5′端则与CA17原型株G-12相似度较高。Bootscan分析显示A240在5′-UTR区可能与EV99原型株BAN00-10461发生了重组,在2B区、2C区、3A区及3C区5′端可能性与CA24原型株发生了重组,在3C区5′端可能性与CA19原型株发生了小片段重组,3D区则可能与PV2原型株MEF-1和CA11原型株Belgium-1发生了片段重组。RDP4.9共发现A240出现2个典型的重组事件,亲本分别为EV109原型株和CA19原型株以及2015年的深圳分离株KR919804.1和CA11原型株;同时前期研究中发现属于基因型III型的广东分离株KF495604在P1区与EVC96原型株高度相似,在P2及P3区则可能与CA24和EVC102发生了重组,同时在P3区可能与属于基因型II型的2009年EVC96山东分离株HQ415759.1出现了型内重组;而HQ415759.1与EV102原型株在3C区可能出现了重组。3.综合预测、筛选出9条EVC96候选B细胞表位。其中P9(aa282-304:VPYNGTGVDIKEGTLTPITPVNS,VP1)与EVC96多克隆抗体呈阳性反应,与EVC96阴性血清不反应;同时与其他10种常见手足口病病原体多克隆抗体不反应。KLH-P9偶联多肽免疫家兔所得多克隆抗体效价可达1:256 000,同时该多克隆抗体与其他10种常见手足口病常见病原体的全病毒抗原不反应。P9多肽序列在EVC96中国分离株中型内保守性较高,与其他10种手足口病常见病原体原型株相应区域不保守。结论:1.EVC96在我国的起源相同、传播时间长、变异大:EVC96中国分离株均位于系统发育进化树同一分支内,可分为多个基因型,型内、型间的遗传距离大,并出现了型间、型内重组。2.P9为EVC96的特异性B细胞表位,具有良好的抗原性及免疫原性,为EVC96诊断方法的建立及表位疫苗的研发奠定了基础。