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【目的】
胰腺癌是全世界第七大癌症死亡原因，尽管近年来取得了很多研究和治疗进展，但其5年生存率仍不到5%。缺乏有效的早期检测方法是该疾病患者生存不良的最重要原因之一。广泛的肿瘤异质性，以及肿瘤上皮和微环境内成分之间的相互作用网络是决定胰腺癌预后不良的生物学特征。最近的研究表明，长链非编码RNA(IncRNAs)在细胞生长、分化、增殖、侵袭和转移中具有多种生物学功能，在许多癌症中起着至关重要的作用，而lncRNA在胰腺癌低氧微环境中的功能尚不明确。这项研究的目的是阐明低氧环境下lncRNA-MTA2TR(转移相关蛋白2转录调节因子RNA，AF083120.1)在胰腺癌中发挥的调控作用。
【方法】
通过对2个胰腺癌病人的胰腺癌(PC)和癌旁的组织(NP)进行高通量测序，分析了在胰腺癌中表达变化有意义的lncRNA。通过分析，我们选择了MTA2基因附近转录的lncRNA-MTA2TR作为研究对象。通过实时荧光定量PCR评估了其在40对胰腺癌和癌旁组织及各种胰腺癌细胞中的表达。单分子RNA荧光原位杂交(FISH)和Northern印记实验确定了lncRNA-MTA2TR在胰腺癌细胞中的核定位和表达。通过构建lncRNA-MTA2TR的小干扰RNA(siRNA)和过表达质粒，下调或上调胰腺癌细胞中的lncRNA-MTA2TR的水平。MTT和集落形成实验用来测定细胞的增值能力，transwell和划痕实验用来检测细胞的侵袭和转移能力。通过异种种植模型，将转染了敲低lncRNA-MTA2TR 的病毒细胞注入裸鼠体内，进一步探究lncRNA-MTA2TR对细胞增殖和转移能力的影响。
为进一步探索lncRNA-MTA2TR在胰腺癌中的作用机制，使用实时荧光定量PCR和Westernblot用来检测MTA2在lncRNA-MTA2TR上调或下调细胞中mRNA和蛋白质的表达水平。荧光素酶报告实验用来检测lncRNA-MTA2TR对MTA2启动子活性的影响。RNA免疫共沉淀(RIP)和RNApulldown实验用来证明lncRNA-MTA2TR与转录激活因子3(ATF3)的结合。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验用来证明，转录因子ATF3与MTA2的启动子区域结合。免疫荧光和RNA-FISH共染色，用来证明lncRNA-MTA2TR与ATF3结合。
此外，实时荧光定量PCR和RNA-FISH用来检测lncRNA-MTA2TR在低氧条件下胰腺癌细胞中的表达。ChIP实验用来证明低氧诱导因子-1α(HIF-1α)与lncRNA-MTA2TR启动子的结合。荧光素酶报告实验用来检测HIF-1α对lncRNA-MTA2TR启动子活性的影响。蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)用来检测lncRNA-MTA2TR对HIF-1α与MTA2结合的影响。
通过免疫荧光和RNA-FISH共染色，我们检测了组织中lncRNA-MTA2TR和HIF-1α的表达。Kaplan-Meier分析了lncRNA-MTA2TR对胰腺癌患者生存率的影响。皮尔森相关分析用来分析胰腺癌患者中lncRNA-MTA2TR与MTA2表达之间的关系。
【结果】
芯片结果和实时荧光定量PCR结果显示，lncRNA-MTA2TR在胰腺癌患者癌组织中呈现高水平表达。体外和体内实验结果显示，敲低lncRNA-MTA2TR显著抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力。机制研究表明，lncRNA-MTA2TR通过将转录因子ATF3募集到MTA2的启动子区域来促进MTA2启动子的活性，从而上调MTA2的表达。另外，我们发现lncRNA-MTA2TR在低氧下表达上调。进一步的机制研究发现，HIF-1α可以结合在lncRNA-MTA2TR启动子的低氧反应元件(HRE)上，从而增强lncRNA-MTA2TR的启动子活性和转录。我们之前的研究表明，MTA2可以通过脱乙酰作用稳定HIF-1α蛋白，从而进一步激活HIF-1α转录活性。我们的实验结果显示，敲低lncRNA-MTA2TR，MTA2与HIF-1α结合减少，HIF-1α的蛋白稳定性下降。此外，lncRNA-MTA2TR可以促进MTA2转录，MTA2与HIF-1α结合增加，HIF-1α的脱乙酰化作用增加，从而促进HIF-1α的蛋白稳定性。我们的临床数据进一步表明，lncRNA-MTA2TR与MTA2的表达呈正相关，且lncRNA-MTA2TR表达上调与胰腺癌患者的总体生存率降低有关。
【结论】
低氧诱导的lncRNA-MTA2TR将ATF3募集到MTA2启动子并调节MTA2的表达，通过依赖MTA2的脱乙酰基作用增强HIF-1α的蛋白稳定性，从而形成了lncRNA-MTA2TR与HIF-1α的正反馈环路。本研究表明HIF-1α/lncRNA-MTA2TR环路可作为新的胰腺癌肿瘤标志物和治疗靶点。
胰腺癌是全世界第七大癌症死亡原因，尽管近年来取得了很多研究和治疗进展，但其5年生存率仍不到5%。缺乏有效的早期检测方法是该疾病患者生存不良的最重要原因之一。广泛的肿瘤异质性，以及肿瘤上皮和微环境内成分之间的相互作用网络是决定胰腺癌预后不良的生物学特征。最近的研究表明，长链非编码RNA(IncRNAs)在细胞生长、分化、增殖、侵袭和转移中具有多种生物学功能，在许多癌症中起着至关重要的作用，而lncRNA在胰腺癌低氧微环境中的功能尚不明确。这项研究的目的是阐明低氧环境下lncRNA-MTA2TR(转移相关蛋白2转录调节因子RNA，AF083120.1)在胰腺癌中发挥的调控作用。
【方法】
通过对2个胰腺癌病人的胰腺癌(PC)和癌旁的组织(NP)进行高通量测序，分析了在胰腺癌中表达变化有意义的lncRNA。通过分析，我们选择了MTA2基因附近转录的lncRNA-MTA2TR作为研究对象。通过实时荧光定量PCR评估了其在40对胰腺癌和癌旁组织及各种胰腺癌细胞中的表达。单分子RNA荧光原位杂交(FISH)和Northern印记实验确定了lncRNA-MTA2TR在胰腺癌细胞中的核定位和表达。通过构建lncRNA-MTA2TR的小干扰RNA(siRNA)和过表达质粒，下调或上调胰腺癌细胞中的lncRNA-MTA2TR的水平。MTT和集落形成实验用来测定细胞的增值能力，transwell和划痕实验用来检测细胞的侵袭和转移能力。通过异种种植模型，将转染了敲低lncRNA-MTA2TR 的病毒细胞注入裸鼠体内，进一步探究lncRNA-MTA2TR对细胞增殖和转移能力的影响。
为进一步探索lncRNA-MTA2TR在胰腺癌中的作用机制，使用实时荧光定量PCR和Westernblot用来检测MTA2在lncRNA-MTA2TR上调或下调细胞中mRNA和蛋白质的表达水平。荧光素酶报告实验用来检测lncRNA-MTA2TR对MTA2启动子活性的影响。RNA免疫共沉淀(RIP)和RNApulldown实验用来证明lncRNA-MTA2TR与转录激活因子3(ATF3)的结合。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验用来证明，转录因子ATF3与MTA2的启动子区域结合。免疫荧光和RNA-FISH共染色，用来证明lncRNA-MTA2TR与ATF3结合。
此外，实时荧光定量PCR和RNA-FISH用来检测lncRNA-MTA2TR在低氧条件下胰腺癌细胞中的表达。ChIP实验用来证明低氧诱导因子-1α(HIF-1α)与lncRNA-MTA2TR启动子的结合。荧光素酶报告实验用来检测HIF-1α对lncRNA-MTA2TR启动子活性的影响。蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)用来检测lncRNA-MTA2TR对HIF-1α与MTA2结合的影响。
通过免疫荧光和RNA-FISH共染色，我们检测了组织中lncRNA-MTA2TR和HIF-1α的表达。Kaplan-Meier分析了lncRNA-MTA2TR对胰腺癌患者生存率的影响。皮尔森相关分析用来分析胰腺癌患者中lncRNA-MTA2TR与MTA2表达之间的关系。
【结果】
芯片结果和实时荧光定量PCR结果显示，lncRNA-MTA2TR在胰腺癌患者癌组织中呈现高水平表达。体外和体内实验结果显示，敲低lncRNA-MTA2TR显著抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力。机制研究表明，lncRNA-MTA2TR通过将转录因子ATF3募集到MTA2的启动子区域来促进MTA2启动子的活性，从而上调MTA2的表达。另外，我们发现lncRNA-MTA2TR在低氧下表达上调。进一步的机制研究发现，HIF-1α可以结合在lncRNA-MTA2TR启动子的低氧反应元件(HRE)上，从而增强lncRNA-MTA2TR的启动子活性和转录。我们之前的研究表明，MTA2可以通过脱乙酰作用稳定HIF-1α蛋白，从而进一步激活HIF-1α转录活性。我们的实验结果显示，敲低lncRNA-MTA2TR，MTA2与HIF-1α结合减少，HIF-1α的蛋白稳定性下降。此外，lncRNA-MTA2TR可以促进MTA2转录，MTA2与HIF-1α结合增加，HIF-1α的脱乙酰化作用增加，从而促进HIF-1α的蛋白稳定性。我们的临床数据进一步表明，lncRNA-MTA2TR与MTA2的表达呈正相关，且lncRNA-MTA2TR表达上调与胰腺癌患者的总体生存率降低有关。
【结论】
低氧诱导的lncRNA-MTA2TR将ATF3募集到MTA2启动子并调节MTA2的表达，通过依赖MTA2的脱乙酰基作用增强HIF-1α的蛋白稳定性，从而形成了lncRNA-MTA2TR与HIF-1α的正反馈环路。本研究表明HIF-1α/lncRNA-MTA2TR环路可作为新的胰腺癌肿瘤标志物和治疗靶点。