深海环境蕴含着种类和数量极其丰富的微生物资源,是地球上最大的生物栖息地。肽聚糖是深海颗粒有机质（particulate organic matter,POM）的重要组分。D型氨基酸尤其是D型丙氨酸（D-alanine,D-Ala）在海洋沉积物中的丰度非常高。深海环境中,微生物之间的相互作用、微生物矿化利用肽聚糖和D型氨基酸的机制还不清楚,这些问题的阐明是揭示微生物在深海碳氮循环中的作用的关键。另外,热稳定性低限制了海洋适冷酶在生物技术方面的应用,建立一种提高海洋适冷酶热稳定性的方法非常必要。弹性蛋白与肽聚糖的肽段部分具有相似性,也是海洋POM的重要组分。海洋中微生物弹性蛋白酶对弹性蛋白的降解机制还不清楚。本文以深海假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.CF6-2为研究对象,首先研究了该菌与其它海洋细菌的竞争关系,揭示了该菌通过分泌M23家族蛋白酶pseudoalteirn裂解和利用其它海洋细菌的竞争机制。进而研究了 Ps.sp.CF6-2在海洋肽聚糖降解中的作用,详细阐述了蛋白酶pseudoalterin对肽聚糖的裂解和细菌Ps.sp.CF6-2对肽聚糖的利用机制。并且研究了细菌Ps.sp.CF6-2在海洋D-Ala循环中的作用,揭示了Ps.sp.CF6-2的D-Ala代谢通路。在此基础上分析了我们揭示的肽聚糖降解酶M23家族蛋白酶和D-Ala矿化代谢的关键酶在海洋细菌中的存在和分布情况。另一方面,我们研制了一种复合保护剂,该保护剂显著提高多种海洋适冷酶的热稳定性。最后,我们研究并揭示了致病因子pseudolysin和海洋细菌来源的myroilysin这两种弹性蛋白酶对弹性蛋白的裂解机制。1.深海细菌Ps.sp.CF6-2与典型海洋细菌的竞争关系为获取和维护生长所需的空间和资源,微生物之间存在竞争关系。海底沉积物的寡营养条件下这种竞争尤为明显,深海细菌能够分泌抗生素等次级代谢产物用于种间甚至种内的竞争。M23家族蛋白酶可以裂解细菌细胞壁肽聚糖肽段的酰胺键和/或肽键,其作用主要是被细菌用来防御或食物摄取。前期研究表明,Ps.sp.CF6-2能大量分泌M23家族蛋白酶pseudoalteirn。以隶属于不同细菌属的海洋细菌为指示菌（测试菌）,利用平板抑菌实验研究Ps.sp.CF6-2对各菌株生长的抑制作用,发现Ps.sp.CF6-2能抑制不同细菌属的海洋细菌的生长。模拟海洋环境,利用共培养技术,研究深海细菌Ps.sp.CF6-2在菌体可接触模式下对典型海洋细菌的作用,发现Ps.sp.CF6-2能够裂解和利用海洋细菌活细胞。利用半通透性培养装置,研究深海细菌Ps.sp.CF6-2在非接触模式下对典型海洋细菌活细胞的作用,发现Ps.sp.CF6-2能分泌一种裂菌因子,并借助于这种裂菌因子的扩散完成对海洋细菌的裂解和利用。以64株海洋革兰氏阳性细菌和22株海洋革兰氏阴性细菌为测试菌,研究pseudoalterin对海洋细菌裂解作用的广泛性,发现pseudoalterin对大部分测试菌的菌体细胞具有裂解能力;相比于革兰氏阴性细菌,革兰氏阳性细菌对pseudoalteirn更加敏感。据报道,微生物之间的竞争关系能够影响微生物次级代谢产物的产量,我们研究了深海细菌Ps.sp.CF6-2与典型海洋细菌共培养时蛋白酶pseudoalterin的分泌情况,发现其它海洋细菌细胞的存在能诱导Ps.sp.CF6-2分泌pseudoalterin,典型海洋细菌的肽聚糖也有相似的功能。这是首次详细地阐释假交替单胞菌Ps.sp.CF6-2与其它海洋细菌的竞争机制,对于今后研究深海环境中微生物之间的相互作用具有重要意义。2.深海细菌Ps.sp.CF6-2在海洋肽聚糖降解中的作用肽聚糖是深海有机质的重要组分。肽聚糖结构独特,并且肽链中含有D型氨基酸,难被一般的蛋白酶降解,也难被一般的海洋微生物矿化利用。目前对海洋中参与肽聚糖降解的微生物种类和酶的种类还不清楚,对肽聚糖诱导微生物分泌胞外酶的机制以及胞外酶对肽聚糖的降解机制也没有报道。用海洋细菌肽聚糖培养Ps.sp.CF6-2,发现Ps.sp.CF6-2能裂解和利用海洋细菌肽聚糖,可以以海洋细菌肽聚糖为唯一碳氮源进行生长。进而通过生化与RT qPCR实验,研究提纯的海洋细菌肽聚糖对基因psn表达的诱导作用与海洋细菌的噬菌体裂解物对pseudoalterin产量的影响,发现环境残余肽聚糖与噬菌体裂解海洋细菌释放的肽聚糖均能诱导Ps.sp.CF6-2分泌pseudoalterin。接着通过比较野生株、psn基因缺失突变株与回补株裂解海洋细菌肽聚糖的能力,揭示了pseudoalterin在Ps.sp.CF6-2裂解和利用海洋细菌肽聚糖中的关键作用。然后通过检测pseudoalterin对64株海洋革兰氏阳性细菌和22株海洋革兰氏阴性细菌的细胞壁的裂解作用,发现pseudoalterin能够高效裂解多个种属的海洋革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁,裂解作用具有广泛性。最后,用液相质谱联用技术（LC-MS）分析pseudoalterin裂解海洋细菌肽聚糖的酶解产物,确定pseudoalterin在肽聚糖肽链上的酶切位点。发现pseudoalterin能在多个位点切割海洋细菌肽聚糖的肽链,既能切割M23家族蛋白酶普遍偏好的Gly-Xaa键,又能切割N-酰基胞壁酸-Ala之间的酰胺键,L-Ala-D-Glu之间的肽键和赖氨酸残基周围的肽键。这是首次对一个深海来源的M23家族蛋白酶参与深海肽聚糖降解进行详细研究,Ps.sp.CF6-2与pseudoalterin可能在深海碳氮循环中发挥着重要作用。肽聚糖由N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid,NAM）和N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine,NAG）交替排列的聚糖链和交联的肽链组成。为进一步找到Ps.sp.CF6-2分泌的降解肽聚糖糖链部分的糖类水解酶,我们分析了 Ps.sp.CF6-2的胞外蛋白酶表达谱,推测N-乙酰-β-氨基己糖苷酶能够裂解肽聚糖的糖链。但是通过基因敲除和异源表达,我们发现该酶对Ps.sp.CF6-2裂解和利用肽聚糖没有影响,该酶也没有裂解肽聚糖的活性。3.深海细菌Ps.sp.CF6-2在海洋D-Ala循环中的作用在海底沉积物中,D型氨基酸的比例最高可达全水解氨基酸（total hydrolysable amino acids,THAA）的 59%,其中 D-Ala 丰度最高,可达丙氨酸总量的40～50%。虽然已发现海洋环境中存在多种D型氨基酸,但是海洋细菌如何吸收D型氨基酸,以及在胞内如何矿化和再利用D型氨基酸,从而推动海洋中D型氨基酸的生物地球化学循环,目前还未见报道。首先,我们建立了一种圆二色光谱（circulardichroism,CD）定量分析氨基酸对映异构体的新方法。利用CD法建立丙氨酸对映异构体、谷氨酸对映异构体的标准曲线,发现氨基酸浓度与CD数据之间的线性关系非常好。相比于常用的毛细管电泳法（capillary electrophoresis,CE）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）和气相色谱法（gas chromatography,GC）,CD法具有以下优势:无需衍生反应、操作简便、重现性好,可以实现定性和定量测定。CD法应用于氨基酸对映异构体的检测是一个新的尝试,开创了手性识别的新领域。然后,我们研究了Ps.sp.CF6-2对D-Ala和D-Glu的利用,发现Ps.sp.CF6-2能以D-Ala或D-Glu为唯一氮源进行生长,是一个可以矿化利用D型氨基酸的深海细菌。通过转录组测序,发现用D-Ala为唯一氮源培养Ps.sp.CF6-2时,D-Ala代谢通路中编码D-Ala消旋酶的基因racA1和racA2、编码D-Ala转氨酶的基因traA和编码D-Ala连接酶的基因ligA的表达量均上调。进而通过基因敲除和回补验证这些基因的功能,发现D-Ala转氨酶的基因traA和D-Ala消旋酶的基因racA1参与Ps.sp.CF6-2对D-Ala的利用。上述结果揭示了 D-Ala转氨酶和D-Ala消旋酶在Ps.sp.CF6-2矿化利用D-Ala中的关键作用,进而揭示了Ps.sp.CF6-2的D-Ala代谢途径。另外,我们通过对NCBI等数据库中公布的海洋细菌基因组进行搜索,发现肽聚糖降解酶—M23家族蛋白酶和本文揭示的D-Ala矿化代谢的关键酶在深海细菌中广泛存在,并且可能在深海氮循环中发挥重要作用。这是首次对一个深海细菌参与深海D型氨基酸循环进行详细研究。4.提高适冷蛋白酶pseudoalterin热稳定性方法的研制Ps.sp.CF6-2能大量分泌M23家族蛋白酶pseudoalterin,该酶能够裂解弹性蛋白和肽聚糖,对多种致病性革兰氏阳性细菌,特别是耐甲氧西林金葡菌具有很高的裂解活性,在治疗细菌感染等医疗和化妆品领域具有很好的应用潜力。但是,由于长期适应深海低温环境,该酶是一个典型适冷酶,热稳定性差,在较低温度下就极易失活,35℃时半衰期仅为14.13 min,4℃时保存24天后酶活力仅存40%。热稳定性差严重影响了该酶的应用。我们建立了利用冷冻干燥技术将液体pseudoalterin制成干粉的方法。发现pseudoalterin冻干粉的热稳定性很高,4℃保存,20天后仍保持97%的酶活,60天后仍保持86%的酶活。将pseudoalterin制成干粉,也有利于pseudoalterin的储存和运输。我们还研制了一种复合保护剂,该复合保护剂能显著提高液体pseudoalterin的热稳定性。Pseudoalterin酶液与复合保护剂混合后在37℃保存,3天后仍保持80%左右的酶活,5天后仍保持60%左右的酶活,解决了 pseudoalterin在人体温度下容易失活的问题。另外,pseudoalterin酶液与复合保护剂混合后在4℃保存,360天后仍保持90%以上的酶活,解决了 pseudoalterin长期保存容易失活的问题。除了pseudoalterin以外,该复合保护剂也能提高多种其它酶制剂的稳定性,预示着它可以作为一种通用的稳定剂,用于提高不耐热酶的热稳定性。该复合保护剂由葡萄糖、海藻糖、甘油、蔗糖制成,原料易得、制备步骤简单、成本低廉,具有巨大的应用前景。5.弹性蛋白酶pseudolysin与myroilysin降解弹性蛋白的机制的研究近年来,弹性蛋白的组装过程和结构得到深入研究,为研究弹性蛋白酶对弹性蛋白的作用机制奠定了基础。铜绿假单胞菌是一株能够引发眼部、肺部、血液和烧伤感染的条件性致病菌,弹性蛋白酶pseudolysin能够降解弹性蛋白进而破坏机体组织,是其主要的致病因子。弹性蛋白是海底沉积物中颗粒有机氮（particulate organic nitrogen,PON）的重要组分,海洋弹性蛋白酶资源很丰富,但是目前对海洋来源的弹性蛋白酶的研究和开发很少。深海沉积物细菌Myroides profundi D25能够分泌一种新型弹性蛋白酶myroilysin。除了能够高效裂解弹性蛋白,myroilysin还有很明显的胶原蛋白膨胀能力,可以协助胶原蛋白酶对胶原蛋白进行降解。为深入了解铜绿假单胞菌的致病机理和海洋细菌弹性蛋白酶的生物技术应用潜力,探索pseudolysin和myroilysin裂解弹性蛋白的机制是非常重要和关键的。首先,我们研究了 pseudolysin结合弹性蛋白的机制,发现pseudolysin与弹性蛋白之间存在明显的疏水相互作用。然后通过定点突变发现S1’位的Val137、Leu197、Leu132、Phe129和S1位的Tyr1 14这五个疏水氨基酸在pseudolysin结合弹性蛋白时起关键作用。这些氨基酸位点可以作为药物设计靶点,在铜绿假交替单胞菌感染时封闭pseudolysin的弹性蛋白结合位点。另外,我们研究了 myroilysin吸附和降解弹性蛋白的机制。首先通过生化实验发现myroilysin与弹性蛋白之间存在明显的疏水相互作用。然后对myroilysin在牛弹性蛋白和人源重组弹性蛋白原上的酶切位点进行分析,发现myroilysin倾向于裂解P1和/或P1’位为疏水氨基酸的肽链。通过观察myroilysin降解交联弹性蛋白原的过程,发现myroilysin倾向于破坏交联弹性蛋白原的小球而不是交联,表现了疏水倾向性。我们的研究为myroilysin在生物技术领域的开发应用奠定了基础。综上所述,本论文对深海细菌Ps.sp.CF6-2及其分泌的蛋白酶pseudoalterin在深生物竞争、肽聚糖降解与D型氨基酸循环中的作用和生态学意义进行了较为深入的研究,研究结果有助于我们更好地认识深海微生物在深海物质循环中的作用,更好地认识深海及全球的碳氮循环。另一方面,弹性蛋白也是海洋POM的重要组分,我们研制了一种复合保护剂用以提高弹性蛋白酶pseudoalterin的热稳定性,并且揭示了弹性蛋白酶pseudolysin和myroilysin吸附和降解弹性蛋白的机制。