【研究背景及意义】 Flt3配体(Flt3 Ligand，FL)是一种能够调节早期造血的关键性细胞因子，与Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3 (FMS-like tyrosinekinase 3) 结合，在多种疾病的病理生理过程中起重要作用。人的 FL 基因位于染色体 19q13.3-13.4，约为5.9kb，其cDNA由8个外显子构成。突变研究证明外显子1～5(胞外区的大部分)编码了具备生物学功能所需的足够信息。人FL蛋白属于Ⅰ型跨膜蛋白，包括两个N-末端糖基化区域，由235个氨基酸组成。开始的26个氨基酸组成信号肽，成熟蛋白质不含此序列。以下顺序为细胞外区(156个氨基酸)，跨膜区(23个氨基酸)以及胞浆区(30个氨基酸)。FL通过差异剪接形成跨膜型和可溶型两种主要形式，两种均有生物学活性，人FL的主要剪接体是跨膜型蛋白，在细胞表面发挥生物学作用，它也可以被蛋白酶裂解成可溶性FL。 目前研究发现FL单独作用对刺激造血的效果并不明显，但它与IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF 和 SCF等细胞因子联用，对原始造血干/祖细胞能产生强烈的增殖效应，其机制为FL与FLT3受体结合后，后者发生二聚体化，使得激酶结构域的构象发生改变，酪氨酸残基磷酸化，RAS-GAP、PLC-7、PI3-激酶、STAT5和EI1/2 等底物蛋白被激活，通过一系列细胞内信号传递，细胞增殖信号转导入细胞核，从而使造血干细胞发生增殖和活化。此外，FL还可促进前B淋巴细胞和T淋巴细胞的生长、分化，对DC细胞和NK细胞具有促进分化、使其功能成熟等作用。 由于FL不仅能刺激造血，还能提高机体的免疫功能，因此在干细胞体外扩增移植、外周血干细胞动员、肿瘤免疫治疗和防治辐射所致骨髓抑制等方面具有诱人的应用前景。 目前国内外研究主要用酵母或大肠杆菌来表达FL蛋白。本课题从人外周血单个核细胞分离出 FL cDNA，将其与真核表达载体 pcDNA3.0连接，并在真核哺乳类CHO细胞中获得FL的较高表达，以便使FL更好地应用于临床。 【方法】 从新鲜的健康人外周血单个核细胞中提取总RNA，逆转录为cDNA。根据Genebank中FL序列(登记号NM001459)的FL胞外段基因序列设计内、外侧引物各一对，内侧引物含BamH I和EcoR V酶切位点，PCR扩增cDNA。PCR产物和真核表达载体pcDNA3.0分别经双酶切后凝胶回收纯化，用T4连接酶连接，转化用氯化钙法制备的感受态大肠杆菌DH5α。从氨苄青霉素阳性的LB转化平板上随机挑取单菌落，增菌并提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定，含有目的片断的为阳性重组子，对FL-pcDNA3.0插入片段进行序列测定。 采用无菌操作提取并纯化FL-pcDNA3.0质粒，用脂质体转染法转染中国仓鼠卵巢细胞CHO，转染后24小时用G418 400μg/ml选择培养基培养，扩大培养阳性克隆，获得稳定生长并表达FL目的蛋白的阳性克隆细胞株。提取细胞总蛋白，用Western Blotting法鉴定转染细胞表达FL蛋白的分子量。 【结果】 人外周血单个核细胞分离出中提取的总RNA经RT-PCR扩增，1.5％琼脂糖凝胶电泳可见一条特异性条带，位置接近500bp，其大小与预计片段大小基本一致，而阴性对照未见任何条带。阳性重组子经PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳可见目的条带，经双酶切后显示目的条带和5.4kh的pcDNA3.0条带。序列测定结果与Genebank中FL序列(登记号NM001459)同源性为99.8％。用脂质体转染法将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞CHO，经筛选和鉴定得到稳定表达FL的阳性转染细胞克隆，Western Blotting证实转染细胞表达蛋白的分子量为24kD。 【结论】 1、利用RT-PCR技术成功扩增了FL胞外段基因，经序列分析显示扩增片断的序列正确。 2、构建了FL真核表达载体，成功地建立了稳定的FL的真核表达体系，为FL的相关研究和应用开发提供了基础。