有机磷酸酯类物质是人工合成的一类高毒化合物,包括磷酸酯类、磷酸硫醇酯类等多种类型,广泛应用于农药杀虫剂、除草剂等,部分化合物还曾作为化学战争中的神经毒剂。例如,马拉硫磷在美国等多个国家广泛用于防治粮食、蔬菜、烟草、茶等农作物上的抗病虫害。由于自然进化的生物催化体系对这种人工合成的化合物降解能力有限,因此有机磷化合物对环境安全和人类健康造成了很大的威胁。有机磷水解酶通过水解有机磷化合物的磷酯键,降低其毒性,是一种可靠的生物修复和解毒的方法。很多研究表明有机磷水解酶活性可能是在自然选择的压力下从具有内酯酶性质的祖先进化而来,因此现已报道的有机磷水解酶受制于低催化效率、低热稳定性或低表达量,能够满足应用需求的有机磷水解酶及其突变体仍然较少。本课题研究目标是:通过基因工程、蛋白质工程技术手段得到稳定的新型有机磷水解酶,能够迅速降解常见农药,并进一步实现重组酶的高效表达以及固定化酶制剂的制备,提高其在生物降解领域的应用潜力。文献报道通过蛋白质工程改造可以获得活性较高的有机磷水解酶,本文首先以部分己报道的具有较高活性的有机磷水解酶为探针,通过基因组数据库分析,从含有42个重组同源酶的酶库中筛选获得了来源Pseudomonas oleovorans的PoOPH,具有一定的有机磷水解酶活性并表现出良好的热稳定性。有趣的是PoOPH同时表现出高效的内酯酶活力,推测该内酯酶活性可能是PoOPH的天然酶活性。序列比对分析揭示其活性中心保守位点His250和Ile263为影响活力的关键位点,本文通过对这两个位点进行定点突变改造极大地提高了其有机磷水解酶的活力:具有双突变H2501/1263W的突变体PoOPHM2对甲基对硫磷和乙基对氧磷的催化效率分别比母本提高了 6962倍和106倍,同时其内酯酶和羧酸酯酶的活力则显著的下降。通过两个氨基酸残基的突变使该酶的底物特异性发生了 1.4 × 107倍的剧烈转变。值得注意的是,PoOPHM2仍然保持了母本极佳的热稳定性,T5015值达到76.5℃。实验进一步观察到H2501/1263W双突变策略同样也能够提高PoOPH同源酶的有机磷水解酶活力,如本课题筛选到的来自Pseudomonas putida的新酶PpOPH采用类似的双突变方法,对甲基对硫磷的活力从原来的0.04 IU/mg提高到 41.0 IU/mg。为了阐明有机磷水解酶双突变体PoOPHM2活性显著提高的分子机制,课题进行了PoOPHM2的晶体结构解析(分辨率为2.25 A),通过与底物甲基对硫磷和乙基对氧磷的分子对接,观察到H2501和I263W突变提高了酶与底物结合的疏水作用力,双突变使得有机磷农药更容易与活性口袋结合。结合结构和动力学分析,250位氨基酸对内酯酶活力有决定作用,而263位氨基酸主要影响有机磷水解酶活力。由于有机磷农药种类繁多,目前已报道的有机磷水解酶仍难以高效降解各类有机磷农药,例如高活力的马拉硫磷降解酶较少见诸于报道。为了拓展有机磷水解酶的底物谱,本课题以PoOPHM2为起点,通过自行设计的分层迭代突变法(Hierchachical Iteration Mutagenesis,HIM)对酶进行分子改造,以获得对常用农药马拉硫磷的高水解活力并保留突变体较好的热稳定性。首先对PoOPHM2活性位点的氨基酸进行迭代饱和突变,优化最适的底物结合位点;随后通过易错PCR法搜寻活力提高的热点氨基酸,并通过DNA重排将有益的突变进行重组,所得突变体对马拉硫磷的水解活力提高了 22倍,但是酶的热稳定性发生了明显下降;为了提高突变体的热稳定性,本课题进一步基于FoldX软件计算肽链折叠能量,从而预测可能使酶稳定性提高的突变位点,结合定点突变实验筛选稳定性提高的突变体。整个进化过程中突变位点由核心区域逐渐向表面累积,通过筛选不足9000的突变体库,获得了高效、稳定的马拉硫磷降解酶突变体PoOPHM9,对马拉硫磷的活力比PoOPHM2高25倍,热稳定性T5015为67.6℃。鉴于在大肠杆菌中发酵表达量较低,对PoOPHM9的表达宿主进行改造以提高马拉硫磷降解酶的表达水平,通过序列优化和基因克隆技术,实现了马拉硫磷降解酶在毕赤酵母的重组分泌表达。通过考察不同pH、启动子、碳源对重组酶表达情况的影响,组成型表达菌株X33/pGAPZαA-△poophm9可利用葡萄糖或甘油作为碳源,蛋白产量达到4.1 g/l,时空产率为640U/(l·h),显著高于重组大肠杆菌发酵水平(0.1 g/l;200U/(l·h))。该重组酵母菌发酵工艺简便,培养基成分简单,无需添加甲醇,发酵过程中无目标蛋白降解,具有良好的应用开发前景。为了进一步提高酶制剂的稳定性并且实现循环利用,对马拉硫磷降解酶进行了固定化研究,比较不同的固定化方法,发现交联酶聚集体CLEA-△PoOPHM9具有最高的比活力和活力回收率;树脂交联酶△PoOPHM9@ESR-2具有最优的稳定性,30℃储存30天,重复使用10次,活力均没有损失;而△PoOPHM9海藻酸钙微囊表现出低于游离酶的KM值,能够更加完全地降解马拉硫磷。三种固定化酶具有不同的粒径大小和特点,可满足不同环境条件下的应用需求。