研究目的:发生于肝细胞的肿瘤被称为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),是原发性肝癌中发生率最高的一种病理类型,在世界所有恶性肿瘤中发病率居于第六位,我国HCC发病率居于世界第一位,这与我国高HBV感染率密切相关。近年来,HCC的发生发展机制的研究工作及治疗技术已取得一定进步和发展,HCC的治疗已形成以外科手术切除和经导管动脉栓塞化疗术(TACE)为基础,分子靶向药物治疗、放化疗、肝移植、中医药治疗等多种治疗方法相结合的综合和序贯治疗。尽管HCC的治疗方案不断得到改进和优化,HCC患者的预后情况仍不容乐观,5年生存率仍明显低于大部分消化系统恶性肿瘤。HCC预后差的重要原因是其极强的转移和侵袭能力,对治疗反应差,且目前关于HCC发生发展的具体分子机制研究甚少。因此,从分子的层面探索和阐明HCC的发生发展、复发转移的确切机制,可能能够筛选HCC新的、有效的诊断和治疗靶点,为HCC的早期诊断和治疗开辟新的方法和途径。在人类基因组中,超过90%以上的序列可以转录,但只有不到2%的序列转录为编码RNA(coding RNA),即可编码蛋白质的信使RNA(messenger RNA,mRNA)。而其余可转录的基因组序列转录成为不具有蛋白编码功能的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。ncRNA广泛参与生命现象的各个环节,包括生长、分化、发育、凋亡和免疫等,也参与恶性肿瘤形成的关键环节。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是ncRNA的重要组成部分,可定位于细胞浆或/和细胞核中,其核苷酸长度超过200nt,但缺乏编码蛋白质的能力。近年来研究表明,lncRNA可以以RNA的形式广泛参与胚胎发育、染色质重构、细胞增殖、分化、凋亡及核内运输等多种生物学过程,同时,lncRNA异常表达与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。HCC的相关研究表明,lncRNA在HCC细胞的增殖、凋亡和侵袭中起重要作用,如lncRNAAB209630能抑制HCC的增殖和转移。lncRNA TUG1在HCC中通过结合miR-132调节Hedgehog通路。linc0052还可通过结合miR-452-5p升高EPB41L3,从而抑制HCC的迁移和侵袭。我们课题组查询相关文献发现,INK4位点的反义非编码RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus,ANRIL)可以作为癌基因在很多癌症的发生发展中发挥关键作用。ANRIL可直接与INK4b-ARF-INK4a基因簇INK4b转录子相结合,形成多梳蛋白抑制复合体(polycomb repressive complexes,PRC),进而抑制 INK4b-ARF-INK4a 转录为 p14ARF、p15 INK4b和p15 INK4a,并进一步通过激活 Ras通路影响细胞周期、促进肿瘤的进展。ANRIL可作为致癌基因并导致肺腺癌对紫杉醇耐药。ANRIL在鼻咽癌中的表达增加,并通过诱导干细胞样癌细胞促进肿瘤进展。ANRIL通过TGF-β/Smad信号通路促进甲状腺癌细胞的侵袭、转移。ANRIL在白血病、前列腺癌、胰腺癌中明显增加,而INK4a、INK4b基因在上述肿瘤类型中的表达明显降低,提示INK4b-ARF-INK4a基因座基因表达功能可能受到ANRIL的调控。但ANRIL影响HCC发生发展、侵袭转移的具体分子生物学机制研究甚少。近年来研究发现,微小RNA(micro RNA,miRNA)在很多恶性肿瘤中是沉默或是升高的。miRNA可以通过3’-非翻译区(3’ UTR)来负性调控相关靶基因的表达,这种功能是通过与靶信使RNA的结合而实现的。例如,miR-488可通过靶向调控ADAM9抑制HCC的增殖和侵袭,下调miR-196a可实现对FOXO1的调节,从而抑制HCC的增殖和侵袭。miR-708可以通过靶向调节SMAD3在HCC中发挥抑癌作用。新近研究证明,miR-384在结肠癌、肺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用。但截至目前,miR-384在HCC中的调节作用的相关研究甚少,其具体的分子生物学机制尚不明确,仍有待进一步研究和探索。LncRNA其中一个重要功能是可以“诱骗”RNA或蛋白质离开原始目标,从而降低其功能。这种“诱骗作用”同样可以发生于lncRNA-miRNA之间。HCC高表达转录本(highly up-regulated in liver cancer,HULC)能够和 miR-372 相结合并抑制其活性,上调HULC的表达可抑制miR-372的表达水平。我们课题组在前期预实验证实,ANRIL在HCC中呈高表达,miR-384在HCC中则呈低表达。在HCC的发生、发展过程中,ANRIL和miR-384是否也存在上述“海绵样”作用,并进一步影响肝细胞癌变的过程,需要我们进一步探讨和研究。信号转导子和转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)是 JAK-STAT(Janus activated kinase-STAT)信号转导途径的关键环节,STAT可介导细胞信号转导,在炎症及恶性肿瘤的发展过程中往往被活化,这些活化过程以STAT3最为常见。生理状态下,STAT3信号转导途径在细胞生长、分化、凋亡过程以及先天及后天免疫调节、胚胎发育、器官形成中发挥非常重要的作用。在病理状态下,STAT3可被多种致癌蛋白如E1蛋白、HCV核心蛋白以及非结构蛋白所激活。激活状态的STAT3能够阻断正常细胞凋亡并进一步促进细胞恶化,在肿瘤的进展过程中,活化的STAT3还可促进肿瘤的血管形成,而血管形成被认为是肿瘤增殖的重要因素。鉴于上述原因,抑制STAT3表达、阻断STAT3的活化对恶性肿瘤的治疗有巨大价值。miRNA可特异的与组成性的活化STAT3耦联,在不同类型的恶性肿瘤中通过靶向STAT3-3’ UTR发挥抗肿瘤作用,如miR-29a、miR-98、miR-410、miR-411。多项研究证实,lncRNA可通过对miRNA的“海绵样”作用调控miRNA的转录和活性,多种miRNA可通过抑制或下调肿瘤相关基因发挥抗肿瘤作用。鉴于ANRIL、miR-384及STAT3在HCC细胞中表达的差异性,我们通过查询相关网站(http://www.noncode.org/index.php https://www.lncipedia.org/)生物信息并推测,ANRIL可能通过影响miR-384及STAT3来调控HCC的发生、发展。探索和研究ANRIL、miR-384及STAT3之间的调控关系,为进一步明确HCC的发生发展原因提供了新思路,为临床工作中HCC的早期诊断、治疗提供了新方法。研究方法:1.细胞培养:实验所涉及的 HCC 细胞系 SMCC7721、HepG2、MHCC-97H、SNU-449 及HUH-7,正常肝细胞系L02,HEK-293T细胞系根据ATCC公司细胞培养标准进行培养。qRT-PCR 方法检测 SMCC7721、HepG2、MHCC-97H、SNU-449、HUH-7等5种HCC细胞系与正常肝细胞系L02的ANRIL及miR-384的表达水平。2.ANRIL的细胞层面功能研究:实验证实,与SMCC7721、HepG2、MHCC-97H等细胞系相比,SNU-449及HUH-7细胞中ANRIL表达水平较高,因此被选为体外研究对象。为抑制ANRIL的表达,我们转染针对ANRIL的LV-shANRIL,在细胞层面应用细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、平板克隆形成、EdU、CCK8、细胞凋亡、细胞周期、Westem-blot等实验方法观察ANRIL如何对HCC的增殖、侵袭、凋亡及转移等生物学行为产生影响。3.ANRIL靶基因的预测、验证及功能研究:鉴于ANRIL、miR-384及STAT3在HCC细胞中差异性表达,我们进一步查询前言中介绍的关于lncRNA的相关网站,分析ANRIL基因定位,了解相关生物信息。我们预测,ANRIL可能与miR-384存在相互作用,并影响其下游靶基因STAT3的表达,发挥其生物学作用。我们通过双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫共沉淀实验、RNA pull-down实验验证上述生物学机制。4.实验动物模型建立与研究:裸鼠皮下成瘤实验观察不同处理组的HUH-7细胞在裸鼠体内的成瘤和成长能力。免疫组化检测Ki-67在裸鼠成瘤组织中的表达。qRT-PCR方法检测不同处理组裸鼠成瘤组织中ANRIL、miR-384、STAT3的表达水平。Western blot检测STAT3蛋白表达情况。结果:1.HCC细胞中ANRIL表达水平增加,miR-384表达水平降低。采用实时荧光定量PCR方法检测HCC细胞系SMCC7721、HepG2、MHCC-97H、SNU-449、HUH-7 和正常人肝细胞株 L02 中 ANRIL 和 miR-384 的表达。ANRIL在HCC细胞系中的表达量与正常肝细胞系L02相比显著增加。除此之外,与正常人肝细胞相比,所有HCC细胞系中miR-384的表达水平显著降低。这些数据表明,ANRIL和miR-384在HCC中的表达水平呈负相关。2.敲除ANRIL可抑制体外培养的HCC细胞的增殖。为了研究ANRIL是否能影响HCC细胞增殖,我们采用LV-NC及LV-shANRIL分别感染SNU-449和HUH-7细胞系。在HCC细胞中,ANRIL被LV-shANRIL沉默。我们观察到HCC细胞系中ANRIL表达水平降低后,HCC细胞的存活率明显下降。此外,EdU实验表明HCC细胞增殖受到LV-shANRIL抑制。我们还发现,敲除SNU-449和HUH-7细胞株的ANRIL大大抑制了 HCC细胞集落形成能力。这些结果表明,敲除ANRIL能够抑制HCC细胞增殖。3.敲除ANRIL可使HCC细胞周期G1期比例增加,并可诱导HCC细胞凋亡。实验显示敲除ANRIL增加了 HCC细胞周期G1期细胞的百分比,而降低了 S期细胞的百分比,这表明抑制ANRIL阻断了细胞周期的进程。此外,LV-shANRIL能显著增加HCC细胞的凋亡。上述实验表明沉默ANRIL抑制了 HCC细胞的细胞周期进程,并可诱导HCC细胞的凋亡。4.沉默ANRIL抑制HCC细胞的迁移和侵袭。我们采用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验来研究ANRIL对HCC迁移与侵袭能力的影响。细胞划痕实验结果显示,LV-shANRIL显著抑制HCC细胞的划痕愈合,Transwell侵袭实验结果显示HCC细胞的侵袭能力被LV-shANRIL明显抑制。提示沉默ANRIL可抑制HCC细胞在体外的迁移和侵袭。5.ANRIL和miR-384具有双向调控作用,ANRIL可通过靶向作用于miR-384调控HCC的发展。为评价ANRIL和miR-384的相互作用,用LV-shANRIL及LV-NC分别感染SNU-449和HUH-7细胞。在HCC细胞中,敲除ANRIL使miR-384表达显著增加。接下来,为了探讨ANRIL与miR-384之间是否存在“海绵样”作用,我们进行了RIP分析,并且观察到与IgG对照组相比,Ago2抗体组中的ANRIL和miR-384更加丰富。此外,使用生物素化的miR-384(miR-384-bio)探针的RNA pull-down试验显示出比对照(NC-bio)或突变型miR-384(miR-384-bio-mut)更高的ANRIL水平。然后,观察miR-384是否能调节ANRIL水平,用miR-384模拟物转染HCC细胞48小时。结果表明miR-384的过度表达抑制ANRIL表达。此外,我们观察到miR-384过表达显著抑制SNU-449细胞增殖,抑制细胞周期进程并诱导细胞凋亡。此外,miR-384过表达可以抑制SNU-449细胞的迁移和侵袭。这些结果表明,ANRIL能够通过靶向作用于miR-384来调节HCC的发展。6.STAT3是miR-384的直接作用靶点。为了探讨miR-384在肝细胞癌进展中的具体作用机制,我们预测STAT3是miR-384的作用靶点。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-384能够显著减弱野生型STAT3报告载体的荧光素酶活性,而对突变型STAT3报告载体没有明显的抑制作用。另外,miR-384模拟物在HCC细胞中抑制STAT3表达。这些结果表明STAT3可以作为miR-384的直接作用靶点。7.下调ANRIL抑制HCC在裸鼠体内的进展。建立HUH-7细胞BALB/c裸鼠异体移植模型,以确定沉默ANRIL是否能抑制体内HCC的进展。实验分为两组,一组在前背部注射LV-NC感染的HUH-7细胞,另一组注射LV-shANRIL感染的HUH-7细胞。饲养2周后,每3天记录肿瘤的体积,饲养6周后从裸鼠皮下剥离肿瘤,我们观察到抑制ANRIL以时间依赖的方式极大地抑制肿瘤生长。与对照组相比,LV-shANRIL明显降低了肿瘤重量。免疫组化数据显示Ki-67的表达被LV-shANRIL抑制。同时,敲除ANRIL通过影响miR-384在体内抑制STAT3的表达。以上结果提示下调ANRIL可通过靶向作用于miR-384和STAT3抑制HCC的发生发展。结论及意义:1.与正常肝脏细胞相比,ANRIL在肝细胞癌中表达明显增加,体外实验证明,敲除ANRIL可抑制肝细胞癌的生长、增殖、侵袭及转移等生物学过程。2.ANRIL和miR-384具有双向调控作用,miR-384在肝细胞癌中表达明显降低,miR-384过表达可通过下调STAT3的表达抑制肝细胞癌的发展。3.ANRIL通过调节miR-384及STAT3的表达实现对肝细胞癌的生长、增殖、侵袭及转移等生物学过程的调控。4.ANRIL可能成为肝细胞癌一个新的诊断、预后和治疗靶点。