基于转录组测序技术探究胰岛素信号通路在白蚁寿命调节中的作用

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蜜蜂、蚂蚁和白蚁等社会性昆虫不同品级间寿命差异非常大,有的类群不同品级间甚至会有两个数量级的差异。白蚁的生殖品级蚁后和蚁王可以活20年,而非生殖品级工蚁、兵蚁只能活几周到几个月。此外,白蚁群体的所有个体都具有相同的遗传背景,寿命的差异是由于基因表达的差异来决定的,从而导致生殖品级蚁后和蚁王超常的寿命和持续的生殖能力。胰岛素是一种蛋白质激素,可通过细胞中的信号转导来控制糖、脂肪和蛋白质的代谢,影响生长和发育过程,例如生殖和衰老。从线虫到果蝇,以及啮齿动物和其他更高等的动物,葡萄糖信号传导机制都高度保守。在秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans和黑腹果蝇Drosophila melanogaster中就已经发现了因胰岛素信号转导的缺陷而导致的寿命增长的现象。但白蚁这类品级间寿命差异很大的社会性昆虫中尚无胰岛素信号与寿命调节的相关报道。本研究以黑胸散白蚁Reticulitermes chinensis为材料,采用婚飞成虫建立人工巢群,经多年培养,成为品级齐全的实验巢群;利用Illumina Hi SeqTM 4000平台对黑胸散白蚁原始蚁王(PK)、原始蚁后(PQ)、雄性工蚁(WM)和雌性工蚁(WF)进行转录组测序分析,比较不同品级间胰岛素信号通路相关基因的差异;采用实时荧光定量PCR方法验证转录组测序结果的准确性;通过分析黑胸散白蚁不同品级之间胰岛素信号通路相关基因表达的差异,探究胰岛素信号通路调控白蚁寿命的机制。主要研究结论如下:(1)饲养四年的黑胸散白蚁巢群中,原始蚁王和雌雄性工蚁的腹部宽度和体长有显著性差异,原始蚁后和雌雄性工蚁的腹部宽度和体长也有显著性差异。但同龄期不同性别工蚁的腹部宽度和体长都没有显著性差异,原始蚁王、蚁后的腹部宽度和体长也存在显著性差异。原始蚁后存在着明显的膨腹现象(physogastry)。(2)通过Illumina Hi SeqTM 4000平台对黑胸散白蚁原始蚁王、原始蚁后、雄性工蚁和雌性工蚁进行转录组测序。转录组组装获得Unigene161,933个,总碱基数为109,126,456,最短的Unigene长度为201 bp,最长的Unigene长度为19,482 bp,所有Unigene的平均长度为673 bp,GC含量为42.90%,N50值为933。(3)在黑胸散白蚁原始蚁王、原始蚁后、雄性工蚁和雌性工蚁构成的转录组中,四个数据库注释到的Unigene总数为161,933个,其中Nr数据库注释到60,736个Unigene;KOG数据库注释到27,181个Unigene,共涉及25个功能分类;Swissprot数据库注释到31,699个Unigene;KEGG数据库注释到19,291个Unigene,涉及343条生物信号通路;GO数据库注释到的Unigene分别涉及生物学过程、细胞成分及分子功能相关的共59种生理代谢功能。在Nr功能数据库注释中,黑胸散白蚁转录组匹配序列最多的是内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis。(4)在黑胸散白蚁原始蚁王、原始蚁后、雄性工蚁和雌性工蚁构成的转录组中,共鉴定到了9,357个简单重复序列(SSRs),分布在8,194个序列中,其中二核苷酸有3,403个,三核苷酸的数量有4,245个,四核苷酸的数量有1,124个,五核苷酸的数量有178个,六核苷酸有407个。对这些SSRs的鉴定,可以为物种间开展基因组差异性分析、遗传图谱构建等研究提供帮助。(5)按照差异显著性标准(差异基因表达变化2倍以上,且p-value≤0.05)进行筛选,黑胸散白蚁,原始蚁王与原始蚁后之间的差异基因个数为1,026个,上调基因733个,下调基因293个;原始蚁王与雄性工蚁之间的差异基因个数为26,170个,上调基因24,503个,下调基因1,667个;原始蚁后与雌性工蚁之间的差异基因个数为69,511个,上调基因55,671个,下调基因13,840个;雄性工蚁与雌性工蚁之间的差异基因个数为1,926个,上调基因1,160个,下调基因766个。在差异基因GO富集分析中,黑胸散白蚁的原始蚁王、原始蚁后、雄性工蚁和雌性工蚁构成的转录组的差异基因主要分布在细胞过程(cellular process)、催化活性(catalytic activity)、代谢过程(metabolic process)、细胞分离(cell part)、单细胞过程(single-organism process)和结合(binding)这几个功能上。(6)胰岛素信号通路中有两个中心通路,即细胞外信号调节激酶(ERK)/丝裂原活化激酶(MAPK)通路和PI3K-Akt通路。其中,PI3K-Akt通路是昆虫胰岛素的主要信号通路。我们选取了PI3K-Akt信号通路中的6个相关基因进行实时荧光定量PCR来验证转录组测序的结果。实时荧光定量PCR结果显示与转录组测序结果中的差异基因表达一致,两者的相关系数为0.721,说明我们的转录组测序数据真实可靠,可以用于后续的生物学分析。(7)基因表达水平显示,原始蚁王和原始蚁后中Pdk1表达均较低,但不同品级之间无显著性差异(n=3,P=0.04<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,原始蚁后和原始蚁王的akt2-a表达低于雌性工蚁(n=3,P=0.025<0.05)。另外,Tsc2在原始蚁王中的表达高于非生殖品级(n=3,P=0.05≤0.05)。相反,原始蚁王和原始蚁后中的m TOR表达低于雄性工蚁和雌性工蚁品级(n=3,P=0.019<0.05)。此外,EIF4E(n=3,P=0.015<0.05)和RPS6(n=3,P=0.016<0.05)的表达水平在原始蚁后和原始蚁王中显著低于雄性工蚁和雌性工蚁。由此推测,akt2-a、m TOR、EIF4E和RPS6这四个基因的低表达,可能通过抑制癌症细胞的侵袭和转移,抑制细胞的恶性增生,使得原始蚁王和原始蚁后具有更长的寿命。而Tsc2则是一种肿瘤抑制因子,在生殖品级中的高表达也会抑制细胞的恶性增生在生殖品级中的发生。此外Pdk1不同品级之间无显著性差异,也说明黑胸散白蚁和其他模式生物胰岛素信号调节方面可能有所不同。
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