【背景】Galanin，是一种29个氨基酸的神经肽（人为30），广泛分布于啮齿类动物的中枢神经系统（CNS）。Galanin表达的大脑区域包括：腹脑，杏仁核，下丘脑（HT），中缝背核（DRN），蓝斑（LC），视前区等[1,2]，而且其重要的生理功能包括：摄食，学习记忆，内分泌，情绪调节以及睡眠等[3,4,5]。Galanin及其受体广泛表达在大鼠的神经元，影响一些经典神经递质的合成和（或）释放，如：γ-氨基丁酸（GABA），乙酰胆碱（ACh），去甲肾上腺素（NA）和羟色胺（5 - HT）。并且galanin对睡眠中起着重要的调节作用，在快速眼动睡眠剥夺大鼠，脑组织galanin mRNA的表达水平会增加[6]，大鼠睡眠时静脉注射galanin会引起时脑电图的改变，而且有证据显示galanin可以降低蓝斑（LC）的电活动[7]。5-HT神经元广泛分布于中枢神经系统（CNS），其中部分分布于中缝背核（DRN），围绕在脑干中线周围，并广泛投射至大脑[8]。5-HT能系统的功能涉及抑郁，损伤性应激，睡眠以及觉醒的调节等[9,10]。此外，有超过14种的受体亚型分布在大脑，提示其在中枢神经系统具有复杂的功能。最近的一项研究显示，5-HT1B受体的活动能够被诱导，并维持快速眼动（REM），抑制行为状态[11]。5-HT2A受体能够增加慢波睡眠（SWS）和改善睡眠状态。APD125，是一种强效的，选择性5-HT2A受体反相激动剂，可用于失眠的治疗[12]。通过微量渗透计术测量觉醒大鼠海马腹侧细胞外5-HT的水平，而被用来研究5-HT1A和galanin受体在中缝背核（DRN）的相互作用[13]。此外，大鼠中缝背核（DRN）约50％的神经元是5-HT神经元，与galanin神经元共表达，并且在体外对外源性galanin神经元感应迅速[14]。总之，这意味着中缝背核（DRN）5 - HT和galanin神经元在睡眠调控中的复杂机制。P–Chlorophenylalanine（PCPA），是一种5-HT的合成抑制剂，通过与色氨酸羟化酶竞争，产生不可逆的抑制作用，从而，PCPA使大脑内的5–HT耗竭，导致抑郁，甚至失眠的发生[15,16]。失眠的特点就是入睡困难，睡眠难以保持，或没有约束睡觉，伴随白天功能的减退和不良应激[12]。目前，失眠的病理机制仍不清楚。然而越来越多的证据表明，galanin和5-HT可能在睡眠和失眠的发生及过程发挥重要作用。通过以上介绍，我们初步了解到，galanin在睡眠和失眠发生中潜在的作用，部分是基于与5–HT在中缝背核（DRN）的共存。相关神经化学研究提供了第一手证据，galanin与5–HT具有相互作用并可能对其具有调节性[17]。而在失眠模型大鼠体内galanin与5–HT相互关系还未揭示。因此，我们研究失眠模型大鼠不同时间点中缝背核（DRN）galanin神经元的表达情况，以及初步确定与5–HT潜在的相互关系。【目的】本课题旨在：1.研究PCPA致失眠模型大鼠不同时间点行为学的变化，探讨失眠导致的大鼠行为学变化情况，并作为对该模型的一种评价手段。2.研究不同时间点失眠模型大鼠中缝背核（DRN）galanin阳性神经元和5–HT能神经元的表达及数量变化，探讨galanin和5–HT在失眠的病理发生过程中具有的生物学效应，以及两种神经元在中缝背核（DRN）的相互关系。3.研究不同时间点失眠大鼠中缝背核（DRN）表达的galanin mRNA相对质量，探讨随时间变化，galanin mRNA表达的变化情况，并结合行为学以及荧光免疫组化，进一步明确galanin在失眠发生中的生物效应以及在中缝背核（DRN）与5–HT的关系。【方法】分三大部分1.利用5 - HT合成抑制剂PCPA致大鼠失眠，建立大鼠失眠模型，进一步通过行为学实验：强迫游泳实验（FST），悬尾实验（TST），检测不同时间失眠模型大鼠行为的变化。2.利用荧光免疫组织化学的方法，检测不同时间失眠模型大鼠中缝背核（DRN）galanin阳性神经元及5-HT能神经元的表达情况，并使用IPP 6.0软件对表达的galanin阳性神经元及5-HT能神经元计数，分析两种神经元在不同时间的变化关系。3.运过Real-Time PCR（RT—PCR），检测不同时间失眠模型大鼠中缝背核（DRN）galanin mRNA的表达情况，以及与失眠大鼠行为学实验，galanin阳性神经元的表达变化之间的关系。【结果】1.通过在不同时间点对失眠模型大鼠在FST和TST的不动时间（IM）进行统计。发现失眠模型大鼠在FST和TST中不动时间（IM）均在第4天达到最大值（p﹤0.01），即在第4天大鼠活动最少，之后逐渐增多，至第10天接近于正常大鼠。2.通过对不同时间点失眠组和对照组大鼠中缝背核（DRN）照片的观察，发现galanin阳性神经元（绿色荧光）和5-HT能神经元（红色荧光）在形态及分布上无明显差异。然而，galanin阳性神经元在DRN的显色于第4天达到最亮，5-HT能神经元在第4天显色最暗。并使用IPP 6.0软件对不同时间点失眠组和对照组大鼠中缝背核（DRN）galanin阳性神经元及5-HT能神经元计数，结果表明失眠组大鼠galanin阳性神经元在第4天表达最多（p﹤0.01），而5-HT能神经元在第4天表达最少，两者的差距最大，后逐渐缩小，于第10天接近于正常大鼠。3.运用Real-Time PCR（RT--PCR）对不同时间失眠模型大鼠中缝背核（DRN）galanin mRNA的表达情况进行检测。发现失眠组大鼠中缝背核（DRN）galanin mRNA表达的相对质量在第4天达到最大（p﹤0.01），与行为学实验以及神经元表达情况相符，并第10天基本接近于正常水平。【结论】1.通过PCPA可建立稳定的大鼠失眠模型，并且失眠模型大鼠在不同行为学实验中的行为变化趋势基本一致。2. PCPA致失眠模型大鼠中缝背核（DRN）galanin的变化，显示galanin是中枢神经系统（CNS）一种功效强大的神经肽，在失眠的病理发生中具有重要的生物学效应。3.通过对不同时间点失眠模型大鼠中缝背核（DRN）galanin阳性神经元和5-HT能神经元表达的观察并计数，初步显示失眠大鼠中缝背核（DRN）galanin神经元和5–HT神经元之间存在负性的调节关系。4. Real-Time PCR（RT—PCR）对不同时间失眠模型大鼠中缝背核（DRN）galanin mRNA表达情况的检测，显示与行为学实验及神经元表达趋势基本一致，进一步说明galanin在失眠发生中的生物学效应。