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毒死蜱是一种有机磷酸酯类杀虫剂,被广泛应用于经济作物上农业害虫和家庭住宅中卫生害虫的防治。对于哺乳动物和水生生物,毒死蜱不仅具有神经毒性,更具有基因毒性。毒死蜱在农业中的持续大规模使用对环境、食品和公共卫生安全带来重大威胁,这种潜在的生态风险和暴露于环境中的毒死蜱残留所带来的健康风险受到人们的日益关注。生物降解被认为是一种经济、有效的环境污染物修复技术。由于毒死蜱在环境中的主要代谢产物3,5,6-三氯-2-吡啶醇(TCP)具有抑菌活性,使得目前发现的大部分降解菌株只能降解毒死蜱,不能进一步降解其代谢产物TCP。同时,毒死蜱与TCP的微生物降解机理,分子遗传机制及其降解基因,降解酶的研究鲜有报道。为此,本论文以课题组筛选得到的能够高效降解毒死蜱及其代谢物TCP的降解菌株——南通嗜铜菌X1~T(嗜铜菌属的新种)为材料,以菌株X1~T全基因组序列为基础,研究毒死蜱与代谢物TCP的降解特性,利用原核表达探索TCP降解酶的催化机理与降解机制。在生态环境污染物修复上,为TCP及其类似结构有机污染物的降解提供理论依据。主要研究结果如下:1.降解动力学结果显示菌株X1~T能够在24h内将100 mg/L毒死蜱降解92.2%,将20 mg/L TCP降解87%。2.全基因组测序数据分析发现,菌株X1~T质粒上含有opd B基因,编码有机磷水解酶,用于毒死蜱水解。在1号染色体上发现TCP的降解基因簇,其中tcp A与fre基因分别编码2,4,6-三氯苯酚4-单加氧酶与NAD(P)H:FAD还原酶,是TCP降解的关键基因。建立了适合菌株X1~T的RT-q PCR检测方法,确定了最优的内参基因为rpo B基因,并测定了在TCP降解过程中,TCP降解基因簇中各基因均上调表达,且降解酶2,4,6-三氯苯酚4-单加氧酶与NAD(P)H:FAD还原酶受上游Lys R转录调节因子反向诱导调控。3.利用大肠杆菌原核表达方式分别表达了TcpA与Fre,分别对表达载体,IPTG浓度,诱导温度进行优化,得到降解酶TcpA与Fre的可溶性融合蛋白。分别利用多糖树脂与镍柱对融合蛋白进行了纯化。体外降解实验显示,纯化后的降解酶具有降解活性,降解酶可以在2h内将10 mg/L TCP降解90%。TCP代谢产物测定中,2个脱氯产物,3,6-二氯-2,5-二羟基吡啶和3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮被检测和鉴定,确定降解酶TcpA与Fre降解TCP为分步氧化脱氯反应。离子色谱与摩尔比分析进一步确定TCP分子上的3个氯原子都可以被降解酶脱去。4.测定了TcpA与Fre对TCP结构类似物:2,3-DCP,2,4-DCP,2,5-DCP,2,6-DCP,3,4-DCP和3,5-DCP等6种二氯苯酚的降解动力学。通过同源建模获得了降解酶TcpA的三维模型,利用分子对接与点突变验证了由206Phe,101Arg和448Gly氨基酸残基构成的活性口袋。6种二氯苯酚均可以与活性口袋中氨基酸残基形成氢键,且氢键越短,降解活性越高。5.代谢产物测定结果显示,降解酶TcpA与Fre对氯代苯酚降解过程为分步氧化脱氯,首先脱去对位的氯原子,其次脱去邻位的氯原子。且氧化能力与苯环对位基团的吸电子能力正相关,吸电子能力越强,越易被氧化。对氯代苯酚结构类似物的降解发现,降解酶TcpA具有双重的脱卤与脱硝功能,更易适应和用于复杂污染物环境的修复。