心力衰竭(心衰)是大多数心血管疾病的最终归宿。心衰病因中以高血压和冠心病最为常见。心肌损伤是心衰的主要病理生理学机制,其分子生物学机制十分复杂。近年来,microRNA及肥大细胞在心肌损伤中的作用受到广泛关注,有望为心肌损伤提供新的分子治疗靶向。本文对microRNA-497及组胺H2受体(H2R)在心肌损伤中的作用和机制进行了研究,现分别论述如下：第一部分：抑制microRNA-497通过调节心肌细胞凋亡和自噬改善心肌缺血再灌注损伤研究背景与目的对于急性心肌梗死的病人而言,挽救缺血心肌最根本而有效的的方法是迅速恢复血流供应,即再灌注。再灌注能够在一定程度上有效的挽救受损心肌,改善心肌缺血、坏死,但是它同样也会导致心肌细胞死亡,使心功能受损,即缺血再灌注(I/R)损伤。然而再灌注损伤的具体机制并不完全清楚。MicroRNA(miRNA或miR)是一类内源性单链非编码的小RNA。它通过和特定mRNA的3’端非编码区完全或不完全互补,抑制或降解靶向mRNA而发挥效应。单个miRNA能够作用多个mRNA从而调控复杂的病理和生理过程。越来越多的研究证实一些miRNA在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用,提示miRNA可能成为缺血再灌注损伤新的治疗靶点。最近的研究发现miRNA-15(miR-15)家族在心肌缺血和心力衰竭中发挥重要作用。MiR-15家族主要有6个成员：miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、 miR-424和miR-497,它们有着相同的5’端种子序列,因此可能有着类似的调控作用。心梗小鼠注射抑制miR-15的化学试剂能够减少心肌梗死面积；抑制miR-15a或者miR-16能够促进缺血心肌的血管新生；miR-195能够促进心肌细胞凋亡。但是对这一家族中的miR-497研究甚少,其在心血管疾病中的作用仍不清楚。我们通过生物信息学分析发现抗凋亡基因Bcl-2和自噬相关基因LC3B是miR-497的预测靶基因,而这两种基因被公认为参与了缺血再灌注损伤过程。上述研究分析提示着miR-497可能在心肌缺血和心力衰竭中发挥重要作用。本课题旨在揭示miR-497在心肌缺血再灌损伤中的调节作用及其调控机制,为临床治疗缺血再灌注损伤提供新的治疗靶点。研究方法1.心肌缺血和缺血再灌注损伤模型的建立和处理8-10周龄的C57BL/6雄性小鼠,体重约20-25g,甲苯噻嗪(5mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)混合腹腔注射麻醉。经胸骨左侧第四肋间开胸,暴露心脏。以8-0尼龙带针线穿过左心耳下缘1-2mm处的2/3心肌层,短暂结扎或永久结扎左侧冠状动脉(以心电图ST段抬高和心肌变白为标志),其中短暂结扎的动物在诱导心肌缺血45min后解除结扎使其再灌注24h,而永久结扎的的动物则承受心肌缺血24h。缺血再灌注实验分为6组,每组6只,组别为：(1) Sham组；(2)I/R组；(3)Sham+Ad-GFP组；(4) Sham+Ad-miR-497-sponge组；(5)I/R+Ad-GFP组和(6) I/R+Ad-miR-497-sponge组。腺病毒(对照病毒Ad-GFP/vector和敲低miR-497的病毒Ad-miR-497-sponge/sponge)分别于缺血再灌注术前3d心肌直接注射(于心前区、心尖和心后区三点各注射25ul),术后24h处死小鼠,提取心脏,分别进行实时荧光定量PCR、免疫印迹和TTC染色。用于基因和蛋白分析的小鼠心脏保存于-80℃；用于TTC染色的小鼠心脏先冷冻于-20℃15min,取出后均匀切成5片用2%TTC染色进行心梗面积分析。2.细胞分离培养和细胞转染原代分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,利用阳离子脂质体转染法,将双链成熟miR-497(miR-497mimic)瞬时转染至心肌细胞过表达miR-497,36h后收集细胞检测miR-497的水平,评价转染效率,并进行后续试验。或者将抑制miR-497的腺病毒(Ad-miR-497-sponge)直接转染细胞,48h后观察细胞表达的GFP荧光,评价病毒转染效率,并进行后续试验。3.缺氧或缺氧复氧刺激心肌细胞通过建立缺氧和缺氧复氧(A/R)细胞模型来分析miR-497对心肌细胞的作用。实验分组如下：(1)对照组：心肌细胞置于常氧环境;(2)缺氧组：心肌细胞分别置于厌氧环境3h、6h或24h和(3)A/R组：心肌细胞分别置于厌氧环境3h、6h或24h,随后复氧2h。缺氧或缺氧复氧结束后,用实时荧光定量PCR检测心肌细胞miR-497含量。后期实验选取缺氧3h/复氧2h (A3h/R2h)作为刺激条件。细胞转染miR-497mimic36h或腺病毒Ad-miR-497-sponge转染48h后,进行缺氧复氧刺激,随后细胞用于蛋白检测或者检测细胞凋亡和自噬水平。4.实时荧光定量PCR检测microRNA含量提取细胞或组织总RNA后,10ng RNA用microRNA专用逆转录试剂盒(All-in-One TM miRNA Q-PCR Detection Kit)进行逆转录,然后用特异性引物进行实时荧光定量PCR检测miR-497表达水平,U6作为内参。5.细胞凋亡和自噬检测分离原代SD大鼠乳鼠心肌细胞种于P3.5cm的小皿,待进行相应刺激处理后,分别经末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记法(TUNEL)和Hoechst染色标记细胞凋亡。单丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是标记自噬体的荧光染料。50nmol/L MDC孵育细胞10min后4%多聚甲醛固定,用共聚焦显微镜观察自噬小体形成。结果1.心肌缺血和心肌细胞缺氧复氧刺激时miR-497及其预测靶蛋白的表达实时荧光定量PCR检测正常成年C57BL/6雄性小鼠各脏器(心脏、肺、脑、肾脏和肝脏)组织内miR-497的表达水平,发现miR-497在心肌组织里高表达。心梗1d小鼠心肌内miR-497表达开始下降。随着心肌缺血时间的延长,miR-497的表达进一步下降。在心肌细胞单纯缺氧3h或6h,miR-497的表达没有变化,直至24h才开始下降(常氧组：miR-497/U6为0.813；缺氧24h：miR-497/U6为0.459,P<0.01)。而心肌细胞在缺氧复氧刺激下,miR-497在缺氧3h/复氧2h就开始显著下降(P<0.01),随着缺氧时间的延长,miR-497的表达进一步下降。上面的结果提示miR-497可能参与了心肌缺血或缺氧病理生理过程,且与心肌缺血再灌注损伤更相关。因为miR-497在缺氧3h/复氧2h(A3h/R2h)即开始显著的下降,因此后续的实验选取A3h/R2h作为刺激条件。利用数据库TargetScanHuman6.2和miRanda对miR-497的靶基因进行预测,挑选软件交集及预测值高的靶点,选取抗凋亡基因Bcl-2和自噬相关基因LC3B作为研究对象。利用western blot检测发现心梗2w和4w心肌组织中Bcl-2和LC3B蛋白的表达水平均较假手术组显著上调(P<0.05)。同样,心肌细胞接受A3h/R2h刺激后,Bcl-2和LC3B蛋白的表达水平也显著上调(P<0.05)。2.过表达miR-497对心肌细胞凋亡和自噬的影响心肌细胞转染50nM miR-497mimic36h后,real time PCR检测发现心肌细胞中miR-497的表达显著升高(P<0.01)。利用Hoechst染色和TUNEL法检测心肌细胞miR-497过表达对细胞凋亡的影响,结果显示单纯A3h/R2h刺激和50nM的miR-497转染乳鼠心肌细胞均能显著诱导心肌细胞的凋亡(P<0.01)。缺氧复氧刺激前过表达miR-497引起的凋亡心肌细胞数目较单纯进行缺氧复氧刺激更多(vs. A3h/R2h group, P<0.05)。用单丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)标记自噬体,荧光染色结果显示单纯A3h/R2h刺激乳鼠心肌细胞诱导心肌细胞自噬体形成；而乳鼠心肌细胞单纯过表达miR-497自噬体并没有明显增加。相反,在进行缺氧复氧刺激前过表达miR-497能减少缺氧复氧刺激诱导形成的自噬体。结合上面的结果,我们发现缺氧复氧刺激诱导心肌细胞凋亡和自噬体形成,而过表达miR-497预处理时,细胞自噬体的形成减少而凋亡的细胞数目进一步增加,细胞活性进一步降低。3.抑制miR-497表达减轻缺氧复氧刺激对心肌细胞的损伤心肌细胞转染腺病毒Ad-miR-497-sponge (MOI=10)48h后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GFP的表达,可见90%以上的心肌细胞表达GFP。同样利用Hoechst染色和TUNEL法检测抑制心肌细胞miR-497表达对细胞凋亡的影响,结果显示A3h/R2h刺激显著诱导心肌细胞的凋亡(vs. normoxia+control group,P<0.01),而单独转染Ad-miR-497-sponge对心肌细胞凋亡数目没有影响。在进行缺氧复氧刺激前抑制miR-497,结果显示心肌细胞凋亡数目较单纯进行缺氧复氧刺激减少(vs. A3h/R2h group, P<0.05)。MDC荧光染色结果显示单纯A3h/R2h刺激乳鼠心肌细胞诱导心肌细胞自噬体形成；在进行缺氧复氧刺激前抑制miR-497心肌细胞能进一步诱导自噬体的产生。上面的结果显示抑制心肌细胞miR-497表达能够减轻缺氧复氧所致的损伤。4.MiR-497调节其靶蛋白Bcl-2和LC3B的表达心肌细胞过表达miR-497,western blot检测发现Bcl-2和LC3B蛋白表达水平下降；相反,抑制心肌细胞miR-497的表达,则Bcl-2和LC3B蛋白表达水平相应升高。提示缺氧复氧刺激心肌细胞导致miR-497表达水平降低可能通过其靶蛋白Bcl-2和LC3B起到作用。5.心肌注射Ad-miR-497-sponge能够减少心梗面积直接心肌注射腺病毒Ad-miR-497-sponge3d后制备心肌缺血再灌注模型,real time PCR检测心肌miR-497表达,结果显示miR-497表达在单纯缺血45min再灌注24h的I/R组较假手术组显著下降(0.30±0.03vs.1.00±0.00,P<0.01)。在心肌注射Ad-miR-497-sponge的假手术组,心肌中miR-497表达下降,而心肌注射Ad-miR-497-sponge的I/R组miR-497水平进一步下降(vs.I/R+Vector:0.16±0.01vs.0.31±0.03,P<0.05)。用TTC染色检测心梗面积显示,心肌注射腺病毒Ad-miR-497-sponge的I/R组较对照病毒组明显减小(24.35±2.46%vs.36.12±2.88%,P<0.05)。结论1.心肌缺血和心肌细胞缺氧复氧刺激时,miR-497表达水平明显下调,而其预测靶基因Bcl-2和LC3B蛋白表达水平相应上调,提示miR-497在缺血再灌注损伤时可能起着重要作用。2.MiR-497可能通过靶基因Bcl-2和LC3B调节心肌细胞凋亡和自噬。3.抑制心肌miR-497表达能够减少心肌缺血再灌注损伤心梗面积,提示抑制miR-497可以作为心肌缺血再灌注损伤的一个新的治疗靶点。第二部分：阻断组胺H2受体通过减轻心肌凋亡和纤维化延缓心力衰竭进程研究背景与目的肥大细胞参与了各种心血管疾病如缺血再灌注损伤、心律失常、动脉粥样硬化、糖尿病所致的心血管并发症和心脏移植等的病理生理过程,在心肌肥厚和慢性心力衰竭中发挥着重要的作用。众所周知,肥大细胞脱颗粒能释放组胺。而在心肌组织中表达的组胺H2受体(Histamine2receptor, H2R),属于G蛋白偶联受体。G蛋白偶联受体激活能够进一步触发胞内多种信号分子,进而影响心功能。有研究报道H2R的阻断剂对慢性心力衰竭患者有利,但是具体的保护机制却并不是十分清楚。我们都知道细胞凋亡和心肌纤维化在心力衰竭发生发展的病理生理过程中起到至关重要的作用。我们以前的研究证实心肌缺血再灌注损伤时H2R被激活,激活的H2R能够诱导心肌细胞凋亡。而这可能也是H2R参与慢性心力衰竭的机制之一。虽然目前还没有研究明确表明心肌纤维化过程中H2R被激活,但是有报道肥大细胞分泌的组胺和肾素能够促进肺组织纤维化。另外组胺对血管紧张素Ⅱ诱导的纤维化具有促进作用,而钙调磷酸酶也参与了血管紧张素Ⅱ介导的心肌纤维化。并且钙依赖性的钙调磷酸酶信号通路在心力衰竭中发挥重要作用。那么H2R激活是否与钙调磷酸酶具有关联呢?虽然已经有一些临床和动物实验研究证明药物阻断H2R能够改善心力衰竭,但是目前还没有研究应用H2R基因敲除动物来证实这一效应,并且心肌纤维化和细胞凋亡是否参与这一过程也不明确。本课题旨在揭示H2R基因敲除对压力负荷诱导的心力衰竭的调节作用,以及它对心肌细胞凋亡和心肌纤维化的调节机制的探讨。研究方法1.小鼠压力负荷模型的建立7-8周龄的组胺H2受体基因敲除(Knockout, KO)和野生型(Wildtype, WT)雄性小鼠,甲苯噻嗪(5mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)混合腹腔注射麻醉。经胸骨左侧第二肋间开胸,进入胸腔后拨开胸腺充分暴露主动脉弓。分离主动脉弓周围结缔组织,用7-0丝线穿过主动脉弓,其上放置一枚27号弯针,将该针与主动脉弓一起用力结扎,随后立即撤针,假手术组小鼠只过线不结扎。用5-0线关胸,小鼠苏醒后放回鼠笼。实验分为4组,组别为：(1)WT-Sham组;(2) WT-TAC组；(3) KO-Sham组和(4) KO-TAC组。手术4w时,超声和左室血流动力学检测小鼠心功能,随后处死小鼠,提取心脏和肺组织,用于后续试验。用于基因和蛋白分析的小鼠心脏保存于-80℃,用于组织学分析的用10%甲醛固定。2.超声心动图检测心功能TAC4w的小鼠麻醉固定后,采用连接17L5高频探头的西门子超声仪进行心脏超声检测。二维超声显示左室短轴切面,应用M超模式记录左心室运动情况,测量左室舒张末后壁厚度(LVPWd)、舒张末内径(LVEDd)和收缩末内径(LVESd)等参数,按照如下公式计算左室短轴缩短率：]LVFS%=(LVEDd-LVESd)/LVEDd×100。3.创伤性血流动力学监测TAC4w的小鼠麻醉固定后,Millar导管经右颈总动脉慢慢引入左心室,连接PowerLab系统,测量左室收缩压(LVSP)、舒张末压(LVEDP)、计算左室内压最大上升和下降速率(max dpldt和min dp/dt)以及收缩指数和Tau指数。4.组织学检测心脏组织经10%甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片后,进行Masson三色染色观察纤维化情况。甲苯胺蓝常用于染心肌肥大细胞。心肌组织石蜡切片常规脱蜡、水化后,浸泡于0.05%甲苯胺蓝染色30min。封片后在高倍镜下观察肥大细胞数目。5.成纤维细胞增殖检测原代分离SD大鼠乳鼠成纤维细胞传代种于96孔板培养24h后,分别加入慢病毒(pLVX-shRNA-calcinuerin, Lv-CN或pLVX,Lv-NC)刺激48h后,继续加入组胺H2受体特异性激动剂AD (amthamine dihydrobromide)刺激24h。实验分为6组：对照(Con)组、AD组、Lv-NC组、Lv-NC+AD组、Lv-CN组和Lv-CN+AD组。处理完后每孔加入10u1的CCK8置于37℃孵箱里培养4h。分光光度计450nm检测每组的吸光度。6.线粒体膜电位检测原代分离SD大鼠乳鼠心肌细胞刺激处理完后分别加入1.0mM的钙黄绿素和25nM的氧化型线粒体探针(MitoTracker)孵育,荧光显微镜下观察两种荧光的强度。四甲基罗丹明乙酯(TMRE)是一种带正电荷的染料。当线粒体通透性增加致使膜电位下降时,TMRE不再积聚,线粒体荧光值下降。50nM的TMRE室温孵育细胞30min,荧光显微镜下观察TMRE荧光强度。结果1.H2R基因敲除减轻压力负荷所致的心功能紊乱我们发现TAC4w的野生型小鼠心肌组织中H2R蛋白的表达升高,肥大细胞数目也增加,提示H2R可能参与了压力负荷诱导心力衰竭这一病理过程。同时我们将H2R基因敲除小鼠制备TAC模型。血流动力学结果显示在TAC4w时,WT小鼠心衰程度更重,导致左室收缩压LVSP降低。与WT TAC小鼠相比,KO小鼠左室舒张末压LVEDP更低、收缩指数更大,提示H2R基因敲除小鼠舒张和收缩功能都有所改善。超声结果显示,与WT小鼠相比,KO小鼠收缩末内径LVESd更小而左室短轴缩短率LVFS更大,也提示H2R基因敲除的小鼠心脏重构减轻。2.压力负荷模型所致的形态学改变对H2R基因敲除小鼠和野生型小鼠分别进行TAC手术,维持4w。称取各组小鼠的心脏和肺组织,计算肺重体重比和心重体重比。KO组的肺重体重比较WT组轻,但是两组的心重体重比却没有显著差异。Masson染色显示两组心肌细胞面积没有差异,但是KO组的纤维化程度减轻。综合上面的结果,我们发现敲除H2R能够减轻压力负荷所致的肺淤血和心肌纤维化。3.阻断H2R抑制心肌成纤维细胞calcineurin的表达众所周知,calcineurin是促心肌肥厚的因子。我们发现在TAC4w野生型小鼠心肌组织中calcinuerin蛋白表达升高,而在H2R基因敲除小鼠心肌中升高的程度要小。这与前面我们观察到的两组小鼠心肌细胞面积没有差异这一结果看似矛盾。为了寻找其中的原因,我们分离原代SD大鼠乳鼠心肌细胞和成纤维细胞进行实验。首先我们检测到心肌细胞和成纤维细胞均表达H2R蛋白。而用组胺刺激两种细胞发现,只有成纤维细胞中calcinuerin的表达升高,心肌细胞中calcinuerin的表达没有变化。进一步用H2R激动剂AD刺激成纤维细胞24h,检测到calcinuerin的表达升高并且H2R特异性阻断剂法莫替丁(famotidine,Fam)能够阻断这一作用。4.Calcineurin介导成纤维细胞组胺H2受体激活诱导的细胞增殖我们构建calcinuerin敲低的慢病毒shRNA-calcineurin,并且能够有效的抑制成纤维细胞中calcinuerin的表达。通过CCK8检测细胞增殖情况发现,H2R激动剂AD能够促进成纤维细胞增殖,而慢病毒shRNA-calcineurin能够阻断这一效应,说明calcinuerin参与了H2R激活促进成纤维细胞增殖这一过程。5.H2R激活对成纤维细胞calcinuerin/NFAT通路的影响我们用H2R激动剂AD刺激成纤维细胞,通过western blot检测发现它能够显著诱导NFATc3核转位以及胞外基质蛋白fibronectin和a-SMA表达的增加；通过realtime PCR检测发现它能够使procollagen I和Ⅲ基因水平也升高。而加入shRNA-calcineurin慢病毒,除了不能使升高的a-SMA蛋白水平下降,它可以阻断AD诱导的其他蛋白和基因的变化。6.阻断H2R对心肌细胞凋亡的影响H2R基因敲除小鼠和野生型小鼠分别进行TAC手术,维持4w。通过TUNEL检测细胞凋亡的情况,发现TAC组小鼠心肌组织凋亡细胞的数目较假手术组的显著增加,而相应KO TAC小鼠心肌中凋亡的细胞要少于WT TAC小鼠。同时检测心肌组织中凋亡相关蛋白Bax和cleavage caspase3的表达,同样发现TAC能够显著的诱导两种蛋白的表达,而相应地KO小鼠心肌中两种蛋白的表达要显著低于WT小鼠。7.H2R激活使心肌细胞线粒体通透性增加,促进细胞凋亡我们用钙黄绿素和Mito Tracker标记心肌细胞的线粒体。染色结果显示组胺和H2R特异性激动剂AD均能使分子探针的荧光强度减弱,表明H2R激活使线粒体通透性增强。而H2R特异性拮抗剂Fam和线粒体通透性转换孔抑制剂CSA都能拮抗这一作用。另外用四甲基罗丹明乙酯TRME染色检测线粒体膜电位。我们发现AD能够显著的降低心肌细胞]TRME的荧光值,而Fam和CSA均能减弱这一作用。进一步我们用组胺刺激心肌细胞24h,检测总蛋白中促凋亡蛋白Bax和cleavage caspase3的表达升高,而用Fam预处理细胞能够减轻这一作用。而用H2R特异性激动剂AD刺激心肌细胞能够诱导Bax线粒体转位,同样的Fam也能够抑制AD诱导的Bax线粒体转位。用TUNEL和Hoechst染色检测细胞凋亡,发现组胺和AD均能诱导心肌细胞凋亡,而Fam能阻断这一作用。结论1.小鼠H2R基因敲除能够抑制压力负荷所致的心肌纤维化和细胞凋亡,延缓心力衰竭进程。2.组胺H2受体激活通过calcinuerin/NFAT通路促进成纤维细胞增殖,胞外基质蛋白fibronectin和procollagen I及Ⅲ基因表达的升高。3.组胺H2受体激活能够使心肌细胞线粒体通透性增加,促凋亡蛋白Bax线粒体转位和cleavage caspase3表达增加,从而促进心肌细胞凋亡。