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背景神经病理性疼痛（neuropathicpain,NP）是一种不愉快感和情感体验,与组织损伤相关联。在临床上有残肢痛、幻肢痛、卒中后痛等。神经病理性疼痛因患病率高、发病机制复杂、治疗困难、易于留有后遗症等原因,给患者的生活及工作造成严重的负担。NP机理包括外周和中枢两种学说,其重要的传导枢纽在脊髓背角。有研究显示,NP的早期既有脊髓背角小胶质细胞被激活,胞体表面的特异性IBA1显著表达。在活化的小胶质细胞上广泛分布着p38MAPK。在病理状态下,p38MAPK在转录水平可以介导NF-κB的激活,其进入细胞核,与相应靶点结合,促进炎性因子的合成及释放,如IL-1β、TNF-α、IL-6。大量炎性因子的高表达,不仅放大了疼痛的级联效应,还进一步的激活了小胶质细胞,他们相互作用,共同参与NP的形成及维持。然而截止到目前,神经病理性疼痛的药物治疗仍然是全球的一个棘手问题,目前,在临床上迫切的需要治疗效果确切、副作用小的新药。当前针对脊髓背角中细胞分子及靶点治疗是热点。有研究显示,传统中草药用于各类慢性疼痛效果良好,博落回是我国传统药物之一,在我国南北均有、野生资源丰盛,并且易于栽培。血根碱（sanguinarine,SG）属于生物碱,大部分提取自博落回的全草,SG具有抑炎、保护神经及心肌、抑菌、抗骨质疏松等作用。随着分子生物学的发展,SG的新功效也被不断的发掘,进而拓宽了 SG的研究领域,为SG在临床实践应用和基础研发中提供了广泛的理论基础。有研究表明,SG可以有效抑制炎性因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）的表达水平;SG还可以通过NF-κB信号通路减弱脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的白介素（IL-1β、IL-6）的mRNA表达上调;SG可以降低TNF-α和IL-6的水平,并且炎性因子的低表达和激活的NF-κBp65呈浓度依赖性;近期研究显示SG抑制了丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）的激活,从而改变了炎症介质的合成和体外释放。此外,SG还可以显著抑制LPS刺激产生的腹腔单核巨噬细胞的活化,对LPS诱导的溃疡性结肠炎有很好的保护作用。然而,SG对NP的作用及机制研究较少。本研究主要是从体内和体外两个方面探讨SG对神经病理性疼痛的作用及可能涉及的分子机制。第一部分血根碱对CCI模型大鼠脊髓背角中小胶质细胞及炎性因子的影响目的:1、通过假手术模型大鼠腹腔注射不同浓度SG来研究SG对假手术组（sham）大鼠的影响。2、建立CCI动物模型,观察SG对CCI动物模型PWT和TWL的作用,并进一步深入研究SG对脊髓背角小胶质细胞及炎性因子的影响。方法:1、为研究不同浓度SG对假手术组大鼠的影响,36只大鼠随机分为4组:sham 组、sham+SG（1.00、2.5 和 6.25 mg/kg）组。2、采用CCI模型。随机分为5组,分别为sham组、CCI组、CCI+SG（1.00、2.5 和 6.25mg/kg）组,每组 45 只。观察术前及术后第1、3、7、14d不同时点测量大鼠疼痛行为学变化,并于各时点取材（脊髓）。通过免疫荧光和ELISA检测脊髓背角小胶质细胞以及TNF-α、IL-1β、IL-6 表达。结果:1、SG对sham组大鼠机械痛阈和热痛阈的影响。测定结果见图 3A,3B,sham+SG 组（1.00、2.50、6.25 mg/kg）与 sham 组相比较,术前及术后第1、3、7、14天大鼠的PWT和TWL无明显变化（P＞0.05）。上述结果提示SG（1.00、2.50、6.25 mg/kg）对假手术大鼠痛阈无具有统计学意义的影响。2、SG对CCI模型大鼠机械痛阈和热痛阈的影响。sham组术前及术后检测的PWT和TWL无显著变化。CCI组术后各时点PWT和TWL下降,以术后第1天下降幅度最大,3、7天仍逐渐降低,下降幅度较缓和,第14天趋于平稳;与CCI组比较,CCI+SG组（1.00、2.50、6.25 mg/kg）术后第3、7、14天PWT和TWL显著逆转。其中,CCI+SG组（6.25 mg/kg）作用较为明显。3、SG对CCI大鼠脊髓背角IBA1+细胞的影响。首先,我们进行了各组组内的比较,发现sham组脊髓背角中IBA1+细胞表达较少,各时点IBA1+细胞表达数量无显著变化;而CCI组术后1天脊髓背角中IBAI+细胞数量略增加,术后第3天、7天、14天IBA1+细胞明显活化。通过细胞计数发现,术后活化的IBA1+细胞数量依术后各时点增加,在第7天达到高峰（P＜0.05）,高位表达至术后第14天,改变趋势与痛阈类似。CCI+SG组（1.00、2.50、6.25 mg/kg）组变化趋势与CCI组相似。然后我们选择变化较为明显的第7天和第14天进行了组间的比较分析发现,CCI组IBA1+细胞表达数量上升。与CCI组相比,CCI+SG组（1.00、2.50、6.25 mg/kg）中IBAI+细胞数量均下降（P＜0.05）,减少幅度随SG浓度递增,SG（6.25 mg/kg）组脊髓背角中IBA1+细胞表达数量减少最为明显。第14天组间比较我们采用免疫荧光merge的方式表现出来。4、SG对CCI大鼠脊髓背角中TNF-α,IL-1β和IL-6的影响。首先我们进行了各组组内的比较,Sham组术前及术后各时间点脊髓背角中TNF-α,IL-1β和IL-6表达无显著变化。CCI组与术前相比较,术后各时间点脊髓背角中TNF-α,IL-1β和IL-6表达呈递增趋势。CCI+SG组（1.00、2.50、6.25 mg/kg）,与术前相比较,术后各时点脊髓背角中炎性因子表达呈递增趋势,其中第7天增幅较为显著（P＜0.05）。然后,将变化较为明显的第7天和第14天进行组间比较分析:CCI组炎性因子的表达均升高。与CCI组相比,CCI+SG组（1.00、2.50、6.25 mg/kg）降低脊髓中炎性因子的表达,其中CCI+SG组（6.25 mg/kg）作用最为显著（P＜0.05）。第7天各组间的变化趋势与第14天相似,但第7天各组间的变化幅度要大于第14天的变化幅度。结论:SG可以通过下调脊髓背角小胶质细胞的活化及炎性因子的表达,提高了PWT和TWL,进而减轻NP。第二部分血根碱对CCI模型大鼠脊髓背角p38MAPK/NF-κB信号通路的影响目的:1、探讨SG在分子蛋白水平对p38MAPK及NF-κB的作用。2、研究大鼠的痛阈值及脊髓背角炎性因子的表达及p38MAPK、NF-κBp65的活化水平,研究SG缓解NP可能的作用机理。方法:1、为研究SG对CCI大鼠脊髓背角p38MAPK和NF-κBp65激活的影响,设计实验1如下:45只大鼠随机分为5组:分别为sham组,CCI组,CCI+SG组（1.00,2.50,6.25 mg/kg）。通过RT-PCR、WB、免疫组化等技术,分析SG对脊髓背角中p3 8MAPK以及NF-κBp65活化水平。2、为研究SG是否通过抑制p38MAPK/NF-κB信号通路激活来调节神经病理性疼痛的痛阈值,我们设计实验2如下:45只大鼠随机分为5组:分别为sham组,CCI 组,CCI+SB203580 组,CCI+SG（6.25 mg/kg）组,CCI+SG（6.25 mg/kg）+anisomycin组。通过RT-PCR、WB、ELISA、免疫组化等技术,分析脊髓背角中炎性因子、p38MAPK以及NF-κBp65活化水平。结果:1、SG对CCI大鼠脊髓背角p-p38表达的影响。我们同时利用WB技术和免疫组化技术检测了腹腔注射SG后脊髓背角中p-p38的表达情况。我们的研究结果显示,CCI组大鼠脊髓背角中p-p38MAPK的表达明显升高（P＜0.05）。然而,通过腹腔注射SG（浓度:1.00、2.50、6.25 mg/kg）能够抑制p-p38表达的上调（P＜0.05）,其中SG（浓度:6.25 mg/kg）的效果最佳。2、SG对大鼠脊髓背角NF-κB p65激活的影响。众所周知,p-p38MAPK信号通路可以调控下游转录因子NF-κB,而NF-κB能够调控炎性因子的表达和释放。因此,我们利用RT-PCR及WB技术检测了大鼠脊髓背角中激活的NF-κBp65蛋白表达。结果显示:CCI组NF-κBp65的表达增加。与CCI组相比较,SG（1.00、2.50、6.25 mg/kg）能够明显降低CCI模型大鼠脊髓中NF-κBp65的激活（P＜0.05）,并且呈现出剂量依赖关系,SG（浓度:6.25 mg/kg）的效果最佳。3、SG对CCI大鼠脊髓背角p38MAPK/NF-κB信号传导通路的影响。结合之前我们的结果,我们提出以下假设:SG是否可通过抑制p38MAPK/NF-κB通路的激活,下调炎性因子的表达减轻NP。提出上述假设后,我们进行如下实验进行验证:1、继续应用CCI模型,于大鼠蛛网膜下腔内注射SB203580,结果发现与CCI组相比较SB203580上调了CCI模型大鼠机械痛阈和热痛阈（P＜0.05）,与CCI+SG（6.25 mg/kg）组相比较,两组均上调了CCI模型大鼠机械痛阈和热痛阈,但差异无明显统计学意义（P＞0.05）;我们也对脊髓背角中激活的NF-κBp65蛋白、炎性因子进行了观察,发现与CCI组相比较SB203580能够显著逆转CCI大鼠NF-κBp65的激活及TNF-α、IL-1β和IL-6的高表达,但与CCI+SG（6.25 mg/kg）组相比较,两组差异无明显统计学意义（P＞0.05）;同时我们CCI模型大鼠于鞘内注射p38MAPK激动剂anisomycin,结果发现与CCI+SG（6.25 mg/kg）组相比较,anisomycin能够下调了SG对机械性痛敏和热敏的作用（P＜0.05）;同时也发现anisomycin明显逆转SG对CCI大鼠NF-κBp65活化的抑制,同时也逆转了TNF-α、IL-1β、IL-6的低表达水平（P＜0.05）。结论:SG可能是通过抑制p38MAPK/NF-κB通路的激活,下调TNF-α、IL-1β、IL-6的表达从而缓解了 NP。第三部分血根碱对体外LPS诱导的BV-2细胞活化的影响目的:1、研究SG和LPS对BV-2细胞活化的影响。2、运用荧光酶标仪检测SG对LPS刺激BV-2后ROS的变化,同时应用WB 技术检测 SG 对 LPS 诱导 BV-2 细胞后 MAPKs、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β的变化,并进一步检测JNK、ERK可能的变化情况。方法:1、以不同剂量的LPS（0-40 μg/ml）和SG（0-10 μg/ml）处理BV-2细胞48h,以检测对BV-2细胞的毒性作用。应用LPS（20,40 μg/ml）联合SG（2.5 μg/ml）共处理BV-2细胞48h,MTT方法检测细胞活性。2、LPS浓度10μg/ml继续实验。LPS和SG共处理BV-2细胞48h,观察BV-2细胞形貌的改变。3、LPS（10 μg/ml）处理BV-2细胞0-48h,荧光酶标仪检测BV-2细胞ROS的产生。LPS（10 μg/ml）联合SG（0.5,1,2.5μg/ml）共处理BV-2细胞48h,荧光酶标仪及显微镜检测ROS的产生。4、LPS（10 μg/ml）处理BV-2细胞0-48h,WB方法检测MAPKs和NF-κB蛋白表达。同时,LPS（10μg/ml）联合SG（2.5 μg/ml）处理BV-2细胞48h,WB方法检测MAPKs和NF-κB蛋白表达。5、LPS（10 μg/ml）联合SG（2.5μg/ml）处理BV-2细胞48h,ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。结果:1、MTT法检测SG和LPS对BV-2细胞活性的影响观察发现:与正常对照组比较,LPS（0-10μg/ml）刺激BV-2细胞48h后,细胞存活率没有发生明显变化。LPS（20μg/ml）处理BV-2细胞48h存活率略降低。LPS（40μg/ml）处理BV-2细胞48h显著抑制细胞生长,细胞活性降低18.4%。在观察SG对BV-2细胞的存活率的影响时,发现SG（0.1-2.5 μg/ml）48 h内未表现出明显的细胞毒性。SG（5,10 μg/ml）表现出明显的细胞毒性,细胞存活率分别降低26.8%和53.9%;当SG（2.5 μg/ml）单独作用或和LPS（10 μg/ml）同时处理BV-2细胞48h时,细胞存活率无明显变化。进一步研究时间依赖性的结果以确认LPS的细胞毒性效果。然而,SG（2.5 μg/ml）和LPS（20、40 μg/ml）同时刺激BV-2细胞48h时,SG共处理却抑制了毒性的发生。例如图1D所示,SG（2.5 μg/ml）显著改善了细胞活性从82.7%到100%。以上结果表明:LPS（0-10 μg/ml）和SG（0.1-2.5 μg/ml）对BV-2细胞无明显毒性作用。当高浓度LPS（20、40 μg/ml）刺激时BV-2细胞产生毒性时,SG在细胞水平可以抑制LPS诱导的BV-2细胞毒性。选择LPS（10 μg/ml）用于后续实验。2、显微镜下细胞形态Control组贴壁非常稳固,胞体呈不规则椭圆形,突起又细又长。与Control组比较,BV-2细胞在LPS刺激48h后,细胞胞体变大,表明BV-2细胞被激活;而加入SG干预后,细胞突起明显减少,表明SG抑制了 BV-2的活化。3、SG抑制了 LPS诱导的ROS产生如图3A所显示,LPS（10μg/ml）处理BV-2细胞可时间依赖性的产生ROS,最早在4h的时候就可以检测到明显的ROS的累积,24h的时候ROS相对于对照组升高了 5 8.4%。然而,SG（0.5,1,2.5μg/ml）共处理可剂量依赖性的抑制LPS诱导的ROS的产生。例如,SG（0.5,1,2.5 μg/ml）分别把ROS的水平从158%降低到 143.8%,135.3%和 1 16.5%。SG（2.5 μg/ml）单独处理 BV-2 细胞未造成明显ROS的产生。图3C的ROS荧光照片结果同上。例如,LPS（10 μg/ml）组表现为明亮的绿色荧光。SG（0.5,1,2.5 μg/ml）共处理后细胞荧光强度剂量依赖性的减弱。以上结果均表明:SG可减少LPS刺激BV-2细胞ROS生成。4、SG减弱了LPS诱导BV-2细胞的MAPKs和NF-κB表达MAPKs和NF-κB信号通路在调控疼痛方面起到至关重要的作用,因此我们以WB方法检测了 BV-2细胞MAPKs和NF-κB通路表达情况。如图4所示,LPS（10 μg/ml）处理BV-2细胞时间依赖性的激活了 MAPKs通路。我们检测到LPS（10 μg/ml）处理 BV-2 细胞后最早 2h 激活了 Thr183-JNK 和 Thr202-ERK,最早4h激活了 Thr180-p38。LPS处理未对总的MAPKs三种蛋白表达产生明显影响。SG（2.5 μg/ml）和 LPS（10 μg/ml）共处理显著抑制了 Thrl83-JNK、Thr180-p38、Thr202-ERK的表达;进一步研究显示,LPS（10μg/ml）处理BV-2细胞时间依赖性的激活了 NF-κB通路,最早在4h的时候检测到明显升高,然而,SG（2.5μg/ml）共处理显著抑制了 LPS诱导的NF-κB的激活。以上结果均表明:LPS（10μg/ml）处理BV-2细胞可造成MAPKs和NF-κB通路的激活。然而,SG（2.5μg/ml）共处理显著抑制了 LPS诱导的MAPKs和NF-κB的激活。5、SG减弱了 LPS诱导的BV-2细胞炎性因子的释放。如图7所示,LPS（10 μg/ml）处理BV-2细胞48h显著增加了 IL-1β、TNF-α和IL-6的表达;然而,SG（2.5 μg/ml）共处理显著抑制了 LPS诱导的IL-1β、TNF-α和IL-6的表达。ELISA和WB两种检测结果基本一致。以上结果表明:SG可减弱LPS刺激BV-2细胞后炎性因子的高表达。结论:SG可明显减轻LPS诱导BV-2细胞的活化,其作用可能与抑制MAPKs/NF-κB通路激活相关。