论文部分内容阅读
目的本研究以体外培养的胃癌细胞MGC803和移植瘤小鼠为研究对象，观察TLR9在胃癌细胞和裸鼠移植瘤组织中的表达。同时，利用TLR9的非特异性抑制剂氯喹（chloroquine, CQ）对TLR9/NF-κB信号通路进行干预，观察TLR9/NF-κB信号通路在胃癌细胞MGC803增殖、迁移以及对IL-6分泌的影响，以及与胃癌发生发展和转移相关的细胞因子：基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)和环氧合酶-2(cyclo-oxygenase-2, COX-2) mRNA表达情况，探讨TLR9的表达及其介导的NF-κB信号通路在胃癌发生及进展中的作用机制，为胃癌建立新的、有效的临床免疫治疗提供理论和实验依据。方法（1）体外培养胃癌细胞MGC803，免疫荧光法检测TLR9在胃癌细胞MGC803中的表达。（2）CCK-8法测定TLR9抑制剂CQ对MGC803细胞增殖活性的影响。（3）ELISA方法观察TLR9抑制剂CQ在不同时间段对MGC803细胞释放IL-6的影响。（4）采用细胞划痕法检测TLR9抑制剂CQ对MGC803细胞迁移能力的影响（。5）运用RT-PCR的方法检测不同浓度TLR9抑制剂CQ作用胃癌细胞MGC803一段时间后对COX-2，MMP-2，MMP-7以及NF-κB p65mRNA表达的影响。（6）建立胃癌的移植瘤裸鼠模型，观察TLR9抑制剂CQ对肿瘤大小及肿瘤转移的影响。（7）解剖移植瘤裸鼠脾脏与肿瘤组织，计算裸鼠的脾指数，观察免疫系统的变化。（8）应用免疫组化的方法观察TLR9抑制剂CQ对肿瘤组织TLR9的表达及组织结构的影响。结果（1）胃癌细胞MGC803上有TLR9的表达，并且主要表达在细胞浆。（2）50μg·mL(-1)、100μg·mL(-1)、200μg·mL(-1)的CQ均能抑制胃癌细胞MGC803的增殖，且呈时间和浓度依赖性（p<0.05）。（3）200μg·mL(-1)的CQ分别作用MGC803细胞24h，48h和72h后均可抑制IL-6的表达，而50μg·mL(-1)和100μg·mL(-1)的CQ仅在作用MGC803细胞72h后方可抑制IL-6的表达，且差异具有显著性（p<0.05）。（4）TLR9/NF-κB信号通路激动剂CpG ODN能够促进胃癌细胞MGC803的迁移（p<0.05），抑制剂CQ能够抑制胃癌细胞MGC803的迁移，并且呈时间-浓度依赖性（p<0.05）。（5）TLR9/NF-κB信号通路激动剂CpG ODN能够促进胃癌细胞MGC803表达NF-κB p65mRNA，COX-2mRNA和MMP-2mRNA，而抑制剂CQ能够抑制此三者mRNA的表达，差异有统计学意义（p<0.05）。对于MMP-7mRNA来说，TLR9/NF-κB信号通路激动剂和中低浓度的抑制剂能够促进mRNA的表达，差异有统计学意义（p<0.05）；而高浓度的抑制剂对mRNA的表达与对照组相比没有统计学意义。（6）在早期将TLR9/NF-κB信号通路抑制后可以抑制肿瘤的增长，而晚期则不能抑制肿瘤的增长；解剖移植瘤裸鼠后在癌细胞种植部位附近的淋巴结、肝、脾中均未观察到有癌细胞的转移灶。（7）SP法检测结果显示TLR9/NF-κB信号通路的激动剂组和空白模型组的肿瘤组织中表达TLR9的阳性细胞数要高于抑制剂组，且差异有统计学意义（p<0.05），且激动剂组和空白模型组均可见明显的坏死灶，而抑制剂组坏死灶要相对较小。结论（1）胃癌细胞MGC803表达TLR9。（2）TLR9/NF-κB信号通路参与了胃癌细胞的增殖与转移。（3）抑制TLR9/NF-κB信号通路可能是胃癌免疫治疗的新靶点。