目的:铜绿假单胞菌是临床上极为常见的条件致病菌，患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌，具有多重耐药的特点。寻找铜绿假单胞菌通过何种途径感知外界的变化，以何种方式改变生理学过程从而适应环境，一直是该菌的研究热点之一。细菌小RNA(small regulatory RNA)是细菌中普遍存在的一类长度在40～500个核苷酸的，具有调控功能的小分子RNA,简称为sRNA(small RNA)，sRNA在广泛细菌种群的许多关键生命进程中发挥重要的调控作用，其调控作用在数量上和多样性上甚至超过了蛋白质。迄今已在铜绿假单胞菌中发现29种sRNA，其中RgsA是由Nicolas González在2008年进行全基因组搜索发现的，存在于铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌中的sRNA，推测可能与铜绿假单胞菌抗氧化应激反应有关，在铜绿假单胞菌生物膜状态下高度表达。铜绿假单胞菌难治性持续性感染与生物膜形成联系密切。在人类感染性疾病中，约有65%与生物膜有关，例如牙菌斑、囊性纤维化肺病、反复发作的慢性中耳炎、慢性骨髓炎、慢性鼻窦炎及慢性伤口感染等。对本研究拟从sRNA RgsA的基本结构、功能、作用机制到调控方式进行深入研究，以探讨该sRNA在铜绿假单胞菌生命活动中的作用。方法:（1）本研究以铜绿假单胞菌PAO1菌株作为实验菌株，根据公用数据库的序列信息和文献资料设计合成引物，采用5′RACE确定转录起始位点，结合Northern blot与计算机预测3′末端转录终止序列，以确定RgsA的基本转录本结构。（2）在此基础上，PCR扩增rgsA同源臂与庆大霉素抗性基因插入自杀质粒pEX18-Ap，构建rgsA基因敲除载体，利用双亲杂交转化铜绿假单胞菌PAO1，构建rgsA基因缺陷株SH2-5。（3） PCR扩增rgsA基因编码片段，插入pJN105质粒阿拉伯糖诱导型启动子的下游，构建rgsA基因表达载体，转化rgsA基因缺失缺陷株SH2-5，构建rgsA基因补偿/过表达株。（3）以生长时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制生长曲线，观察野生株、rgsA基因缺陷株的生长情况。（4）利用Trizol法分别抽提不同浓度过氧化氢，有机过氧化物刺激下铜绿假单胞菌的总RNA，Real-time PCR检测RgsA表达情况。（5）以含有不同浓度过氧化氢，有机过氧化物LB平板作为培养基进行平板实验，以不同浓度过氧化氢与不同反应时间组合，进行MTT实验，比较野生株，缺失株以及过表达菌株在浮游菌状态下抗氧化应激能力。（6）野生株，缺失株以及过表达菌株分别进行生物膜培养，三天后利用不同浓度过氧化氢分别对形成的生物膜进行刺激， SYTO9/PI染色后荧光显微镜观察，以比较三者间在生物膜状态下抗氧化应激能力。结果：（1）rgsA在铜绿假单胞菌中存在两个转录本，转录本长度分别约为300bp与90bp。其中短片段转录本的转录起始位点，位于NCBI注释基因片段起始下游86bp处，长片段转录本的转录起始位点，位于NCBI注释基因片段起始上游157bp处。（2）经PCR及测序证明，铜绿假单胞菌缺陷株SH2-5中缺失rgsA基因，成功构建铜绿假单胞菌rgsA基因缺陷株。经测序证明，过表达质粒pJN105-SH和补偿/过表达菌株SH2S构建的正确性。（3）生长曲线提示rgsA基因缺陷株生长速度明显低于野生株。（4）经Real-time PCR检测，不同浓度过氧化氢以及有机过氧化物刺激下，RgsA表达均有不同程度的增加，尤其在有机过氧化物刺激时表达明显上升。（5）通过计算生长于含有不同浓度过氧化氢与有机过氧化物的LB平板上的菌落数，以及MTT法检测各实验组中细菌总体活性，rgsA基因缺陷株表现出对过氧化氢及有机过氧化物的抵抗能力明显下降，而在突变菌株中导入表达载体后，在0.1%L-Arabinose的诱导下，对氧化应激的抵抗能力恢复到接近野生株的水平。（6）野生株，缺失株，过表达株在流动培养系统中培养3天后形成生物膜，在30mM过氧化氢刺激下，相比野生株及0.1%L-Arabinose的诱导下的过表达株细菌，缺失株出现大面积能被SYTO9染色的死菌（呈黄色）。结论：rgsA在铜绿假单胞菌中存在两个转录本，证明RgsA在铜绿假单胞菌抗氧化应激中发挥重要作用。