研究目的钛及其合金具有优良的机械性能、抗腐蚀性能和生物相容性,是口腔种植体的首选材料。但是钛表面致密的氧化层使得材料呈现一定的生物惰性,导致其植入体内后骨结合较为缓慢;另外该表面不具有抗菌能力、易粘附细菌并形成生物膜,进而引发感染或种植体周围炎,甚至导致治疗失败。故提升材料表面骨结合能力和赋予表面抗菌能力对种植体应用具有重要价值。在众多的钛表面改性方法中,碱热处理可通过调控表面形貌、化学组成、亲疏水性等影响其生物学性能,且具有操作简单且易控制的特点。可以构建出微米级和纳米级孔复合的层级多孔结构,同时表面富含羟基和具有超亲水性能,为随后的生物分子修饰奠定了良好的基础。仿海洋贻贝粘附性的多巴胺分子具有邻苯二酚和氨基,其可以1)自身聚合形成具有更多活性反应基团的聚多巴胺,2)牢固粘附在众多材料表面改善生物相容性,3)实现其他生物分子在材料表面的桥连;4)可以螯合甚至还原金属离子。这些性能使其成为种植体表面改性的重要选择。在广谱抗菌剂中,银具有抗菌能力强、稳定性高、不引发细菌耐药性等优点。与传统银离子相比,纳米尺度的银因尺寸小、比表面积大,具有更强的抗菌能力。本研究通过在纯钛表面进行改性处理,充分利用多孔结构的承载能力和多巴胺的还原能力,期望构建出具有良好的骨结合能力及抗菌性能的多功能涂层,加速种植体植入后的骨结合,同时防止种植体周围炎症的发生,提高种植修复的成功率。另外,本研究对光滑表面和多孔表面上构建的聚多巴胺-纳米银涂层的性能做了详细比较,为种植体设计提供理论和技术支持。研究方法(1)采用碱热处理的方法,在光滑钛表面构建多孔形貌,然后利用水相多巴胺沉积,在多孔钛表面沉积聚多巴胺涂层,最后浸没于不同pH值的硝酸银溶液中,利用多巴胺的还原能力在不同酸碱环境中的多孔钛表面构建聚多巴胺-纳米银涂层。通过场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)、能量色散谱仪(EDS)、X射线光电子能谱(XPS)进行理化性能表征,评估不同酸碱环境对于多巴胺介导纳米银涂层构建的影响。(2)在适宜的酸碱环境中通过相同的方法将银离子在光滑钛表面上也还原为纳米银。通过FE-SEM、XPS、接触角测试仪比较光滑表面和多孔表面构建的各步样品的理化性能及表面润湿性能差别。(3)通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)比较光滑钛表面和多孔钛表面聚多巴胺-纳米银涂层中银离子在矿化液中的释放行为,以及多孔纳米银涂层中银离子在矿化液和在去离子水中的释放行为。(4)通过活死细菌荧光染色、抑菌环试验、浊度法(微生物增殖曲线),考察各制备样品对六种口腔常见微生物的抗菌性能,包括革兰氏阴性菌:大肠杆菌(E.coli和革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌(S.aureus)、变形链球菌(S.mutans)、衣氏放线菌(A.israelii)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和真菌:白色念珠菌(C.albicans)。(5)通过将各制备样品浸泡于仿生矿化液中,模拟样品植入体内后表面性质的变化,并通过FE-SEM和XPS分析各样品表面矿化后的形貌和化学成分组成的变化,分析所得涂层是否具备促进种植体表面非细胞介导的成骨潜能。(6)通过细胞肌动蛋白荧光染色、MTT法及碱性磷酸酶(ALP)活性,分析各制备样品表面及纳米银涂层矿化表面对小鼠胚胎成骨细胞(MC3T3-E1)的影响,评价样品表面对细胞介导的成骨潜力。研究结果(1)FE-SEM、EDS、XPS结果显示硝酸银溶液的pH值影响多巴胺介导的纳米银涂层的构建,相对于酸性及中性环境(pH4、pH7),碱性环境(pHI0)更利于纳米银的沉积,获得的纳米银颗粒数量更多、尺寸更小、分布更均匀。(2)碱热处理后在光滑钛表面形成大量开放型微纳米多孔结构,孔壁为大量支柱样结构,支柱的壁厚约30-50nm。随后在微纳米多孔表面和光滑表面均成功构建聚多巴胺涂层和聚多巴胺-纳米银涂层。与光滑表面聚多巴胺-纳米银涂层相比,多孔表面的涂层获得数目更多、尺寸更小(20-40nm),且形状更均匀的纳米银颗粒。(3)碱热处理后的多孔表面水接触角为25.3±4.1°,较光滑表面(79.0±6.4°)的亲水性得到明显改善;在光滑表面,多巴胺修饰后接触角为66.5±3.4°,亲水性得到改善,但纳米银使表面疏水,接触角略微增加到72.3±3.5°;多孔表面上,聚多巴胺和纳米银则相继影响了表面亲水性,接触角分别增加到50.2±5.4°和76.5±6.7°。(4)ICP-OES结果显示光滑表面聚多巴胺-纳米银涂层在矿化液中呈现了缓慢下降、较高剂量的银释放,而多孔纳米银涂层在矿化液中则呈现为初始阶段高剂量释放、随后低剂量释放。30天后光滑表面涂层中和多孔表面涂层中仍然存在0.11±0.05μg和0.09±0.02μg的银释放,均显示出良好的持续性;多孔纳米银涂层在去离子水中呈现稳定的、高剂量的银释放,累积释放曲线近似于线性,同矿化液中银释放方式明显不同。(5)样品表面活死细菌荧光染色结果显示碱热处理后的多孔表面相对于光滑表面更容易受微生物粘附,在纳米银修饰后,无论是多孔涂层表面还是光滑涂层表面都抑制了六种口腔常见微生物在其上的粘附;抑菌环实验显示纳米银修饰的涂层表面均出现明显、透明的抑菌环,两种涂层均可一定范围内抑制周围环境的微生物增殖;浊度法结果显示两种纳米银修饰的涂层完全抑制了液体环境中的微生物生长,均获得了良好、稳定的抗菌性能。(6)矿化实验后FE-SEM、XPS结果显示碱热处理后的多孔表面相对于光滑表面可以形成更多的矿化产物;聚多巴胺涂层表面的矿化产物最多;多孔表面聚多巴胺-纳米银涂层的矿化产物多于光滑表面聚多巴胺-纳米银涂层,提示多孔纳米银涂层相对于光滑纳米银涂层具有更高的非细胞介导的成骨潜能。不同涂层矿化程度跟表面结构及表面暴露聚多巴胺的量有关。(7)样品表面细胞肌动蛋白荧光染色结果显示纳米银的修饰推迟了成骨细胞的粘附和铺展,但随着培养时间的延长,纳米银涂层表面的成骨细胞MTT、ALP活性均为上升趋势。在对应的时间点,多巴胺介导的矿化涂层表面粘附的成骨细胞数量、形态均优于非矿化的涂层表面,MTT、ALP活性同样高于非矿化纳米银涂层组。此外,相对于光滑结构的纳米银涂层矿化表面,多孔结构的纳米银涂层矿化表面更有利于成骨细胞的粘附、增殖和分化,显示出更理想的细胞介导的成骨潜力。结论与意义本研究通过碱热处理、水相多巴胺沉积、硝酸银溶液浸泡,在微纳米多孔或光滑的钛表面上成功构建聚多巴胺-纳米银涂层。相对于酸性及中性环境,碱性环境的硝酸银溶液更利于多巴胺介导的纳米银沉积;而相对于光滑表面的纳米银涂层,多孔表面上获得了数目更多、尺寸更小的纳米银颗粒,且多孔表面暴露了更多的多巴胺,诱导了更多的矿化,这导致多孔表面纳米银涂层初期银快速释放后,后期纳米银释放快速减少。两种表面构建的纳米银涂层都显著抑制了微生物的粘附与增殖,抗菌性能没有明显差异,证明该修饰涂层解决了多孔表面易发生感染的问题,但纳米银涂层推迟了成骨细胞的粘附与增殖,而多巴胺介导的矿化改善了表面成骨细胞相容性,尤其多孔表面纳米银涂层。因此,本研究推测多孔表面纳米银修饰的涂层材料在植入后初期可以发挥优越的抗菌性能,降低感染风险,植入后随着从体液中逐渐吸附钙磷元素将快速形成矿化层,进一步改善了细胞相容性并促进成骨分化,从而实现骨结合,这符合体内要求,具有临床应用潜力。