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研究背景和目的目前结直肠癌转移是临床患者的主要死亡原因,当结直肠癌确诊时,大约有20%～40%病例已经发生了远处转移,而根治术后再次发生的肝转移率约为50%;结直肠癌死亡的患者中肝转移率高达45%～71%[1]。因而,加强对结直肠癌发生发展机制的研究,阐明结直肠癌发生转移的分子机制,对结直肠癌的转移进行预测、诊断和相关预后判断等是目前结直肠癌研究的前沿,对于减少死亡率、提高治愈率具有重要的科学意义。本课题前期实验发现miR-223通过其下游靶基因FBXO8促进结直肠癌转移,FBXO8在结直肠癌组织中表达下调,但是FBXO8基因在结直肠癌侵袭和转移中的作用机制尚不清楚。FBXO8基因是F-box蛋白家族的一名新成员,F-box蛋白家族属于泛素-蛋白酶体系统,该系统可以介导真核细胞内大多数调控性蛋白的降解,所以对于维持细胞内的稳态、调控细胞的增殖、分化、周期和凋亡等过程中发挥及其重要的作用[2]。泛素对于蛋白的转录后修饰由三个酶介导:E1活化酶、E2交联酶和E3连接酶。F-box蛋白家族特征是具有大约40个氨基酸序列的F-box基序,它作为泛素E3连接酶SCF(Skp1/Cullin/F-box)蛋白复合物中的亚单位发挥其作用,F-box蛋白通过与底物的直接结合来决定底物泛素化的特异性[2]。目前仅有3篇文献报道了FBXO8在肿瘤中的作用。FBXO8可抑制ARF6介导的乳腺癌细胞的侵袭能力[3]。FBX08被发现是一个新的c-Myc结合蛋白,c-Myc通过抑制FBX08的相关功能,来提高癌细胞的侵袭能力[4]。本课题组研究发现FBX08可抑制肝癌细胞的侵袭与转移能力并与肝癌病人的低生存率相关[5]。以上均提示FBX08与肿瘤的演进密切相关。本课题选取FBX08作为靶点,进一步探讨FBX08在结直肠癌侵袭和转移中的功能和相关机制,主要内容如下:(1)明确FBX08在结直肠癌侵袭和转移中的作用;(2)揭示FBX08通过泛素化降解mTOR参与结直肠癌侵袭和转移的新机制。本课题旨在阐述结直肠癌转移和侵袭的分子机制,为临床抗结直肠癌侵袭和转移提供一个新的基因靶点。研究方法1.FBX08对结直肠癌细胞生物学行为的影响(1)设计并构建FBX08慢病毒过表达载体,由公司进行慢病毒上清的包装,感染至结直肠癌细胞株HT29及SW480中,应用流式分选技术分选后构建稳定表达基因的细胞株,利用荧光定量PCR以及Western blot验证FBX08蛋白量的表达变化。(2)利用阳离子脂质体法,将3个商品化的FBX08SiRNAs片段瞬时转染至结直肠癌细胞株SW620中,利用荧光定量PCR及Western blot验证FBX08蛋白量的表达变化,得到Sil及Si3是有效率的干扰片段。设计并构建Si3的FBX08慢病毒干扰载体,由公司进行慢病毒上清的包装,感染至结直肠癌细胞株SW620中,应用流式分选技术分选后构建稳定表达的细胞株,利用荧光定量PCR及Western blot实验验证FBX08蛋白量的表达变化。(3)利用MTT比色法、平板克隆形成实验、细胞周期、体外侵袭实验、检测FBX08过表达和干扰后对体外结直肠癌细胞株增殖侵袭能力的影响。(4)利用整体可视化动物模型,观察FBX08过表达及干扰后对裸鼠皮下成瘤及尾静脉体内转移能力的影响。2.FBXO8在结直肠癌侵袭、转移中作用机制探讨(1)利用Western blot实验观察FBXO8对mTOR的泛素化降解。(2)利用激光共聚焦显微镜和CO-IP实验检测FBXO8与mTOR相互作用,以及构建截短子寻找两个蛋白的具体结合位点。(3)利用MTT比色法、体外侵袭实验探讨FBXO8通过泛素化mTOR调控结直肠癌的侵袭和转移。研究结果1.FBXO8对结直肠癌细胞生物学行为的影响1.1建立FBXO8过表达及干扰稳定细胞株(1)FBXO8稳定过表达后,利用荧光定量PCR检测FBXO8在2种结直肠癌细胞株HT29与SW480中的表达量变化,以各自细胞Mock组为对照(mean±SD:1±0.000),独立样本T检验分析显示,FBXO8在2种细胞株中Mock组与过表达组间的表达具有显著差异。两两比较显示FBXO8在HT29与SW480细胞过表达组中的表达较高,且显著高于各组的Mock组细胞中的表达(P<0.001,P<0.001)。(2)FBXO8瞬时干扰后利用荧光定量PCR检测FBXO8在结直肠癌细胞株SW620中的表达量变化,以细胞NC组为对照(mean±SD:1±0.000),单因素方差分析显示,FBXO8在细胞株NC组与干扰组1和干扰组3间表达具有显著差异(mean=0.141,mean=0.007)与干扰组2间表达没有显著差异(mean=0.73),且有差异组中NC组显著高于干扰组1与干扰组3间细胞中的表达(F=10323.340,P<0.001)。选出干扰片段3稳定干扰后利用荧光定量PCR检测FBXO8在结直肠癌细胞株SW620中的表达,以细胞NC组为对照(mean±SD:1±0.000),独立样本T检验分析显示,FBXO8在细胞株NC组与干扰组3间表达具有显著差异,且NC组显著高于干扰组3细胞中的表达(T=238.247,P<0.001)。(3)FBXO8过表达后利用Western blot检测FBX08在2种结直肠癌细胞株HT29与SW480中的蛋白表达量的变化,结果显示与mock组相比,FBX08在HT29与SW480细胞过表达组中的表达升高。(4)FBXO8瞬时干扰后,利用Western blot检测FBXO8在结直肠癌细胞株SW620中的蛋白表达量的变化,结果显示FBXO8在细胞NC组中的表达最高,在干扰组1与干扰组3中表达较低,NC组与干扰组2间表达没有显著差异。选出干扰片段3进行稳定干扰后结果显示与NC组相比,FBXO8在干扰片段3细胞组表达降低。1.2 FBXO8过表达后对结直肠癌细胞株体外生物学行为的影响(1)利用 MTT 比色法对 HT29/MOCK、HT29/FBXO8、SW480/MOCK、SW480/FBXO8肿瘤细胞的体外增殖能力变化进行检测,并且绘制生长曲线。析因方差分析结果显示:HT29细胞株生长时间水平差异无显著性(F=2490.517,P<0.001),细胞增殖能力组间的差异具有显著性(F=4459.680P<0.001);时间与组间的交互效应无显著性差异(F=525.859,P<0.001);SW480细胞株生长时间水平差异无显著性(F=624.042,P<0.001),细胞增殖能力组间的差异具有显著性(F=1173.557,P<0.001),时间与组间的交互效应无显著性差异(F=131.971,P<0.001)。结果表明,与Mock组相比,FBXO8过表达组的增殖速度明显减慢。(2)利用平板克隆形成实验观察HT29/MOCK、HT29/FBXO8、SW480/MOCK、SW480/FBXO8细胞体外增殖能力的变化,独立样本T检验统计结果显示,HT29/MOCK、HT29/FBXO8 和 SW480/MOCK、SW480/FBXO8细胞株中2组细胞组间的克隆形成能力存在显著差异(T=7.379,P=0.002;T=30.765,P<0.001)。结果提示,与Mock组相比,FBXO8过表达组的增殖能力明显降低(P=0.002;P<0.001)。(3)利用Boyden侵袭小室观察FBXO8过表达处理后,HT29和SW480细胞株的体外侵袭能力变化。独立样本T检验分析结果显示,HT29/FBXO8和SW480/FBXO8组与HT29/MOCK、SW480/MOCK组间的细胞侵袭能力的差异具有显著性(T=11.515,P<0.001;T=18.627,P<0.001)。与 Mock 组相比,HT29/FBX08和SW480/FBXO8细胞穿过膜的细胞数目明显减少(P<0.001;P<0.001),结果表明FBX08抑制肿瘤细胞的体外侵袭能力。1.3 FBXO8干扰后对结直肠癌细胞体外生物学行为的影响(1)采用MTT比色法检测SW620NC、SW620Sil、SW620Si3细胞的体外增殖能力变化进行检测,并绘制生长曲线。析因方差分析结果显示:SW620细胞株生长时间水平差异无显著性(F=1517.886362321,P<0.001),细胞增殖能力组间差异具有显著性(F=268.6163860441 P<0.001);时间与组间交互效应无显著性差异(F=1517.886362321,P<0.001);结果提示,与NC组相比,FBX08干扰组的细胞增殖速度明显升高。(2)利用平板克隆形成实验观察SW620NC、SW620Sil、SW620Si3细胞体外增殖能力的变化,单因素方差分析统计结果显示,SW620NC与SW620Sil、SW620Si3间细胞的克隆形成能力存在显著差异(F=0.19,P=0.011;F=0.24,P=0.009)。结果表明,与NC组相比,FBX08干扰组的增殖能力明显升高。(3)利用细胞周期实验观察SW620NC、SW620Si3细胞周期的变化,两个独立样本T检验分析统计结果显示,SW620NC、SW620Si3组G1期存在显著差异(T=9.624,P=0.001);S 期也在显著差异(T=-14.970,P<0.001);G2 期存在显著差异(T=8.060,P=0.001)。结果表明,与SW620NC相比,SW620 Si3组的进入增殖期的细胞数量明显增加。(4)利用Boyden侵袭小室观察FBX08干扰处理后,SW620细胞株的体外侵袭能力变化。单因素方差分析结果显示,SW620NC、与SW620Si1、SW620Si3间的细胞侵袭能力的差异具有显著性(F=199.20,P<0.001;F=305.6,P<0.001)。与NC组相比,两个干扰组细胞的穿膜数目明显增加(P<0.001;P<0.001),结果表明FBXO8过表达后癌细胞的体外侵袭能力增强。1.4 FBXO8过表达及干扰后对结直肠癌细胞体内生物学行为的影响SW480/MOCK、SW480/FBXO8 与 SW620NC、SW620Si3 4 株不同细胞株进行皮下成瘤和尾静脉注射体内转移实验,裸鼠皮下成瘤单个重复测量因素的方差分析结果显示:两种细胞的组内皮下成瘤能力都具有明显差异(F=9.552,P=0.01487710397974;F=28.525,P<0.001)。比较后发现,MOCK 组的皮下肿瘤生长速度明显快于FBX08过表达组,NC组皮下肿瘤生长速度明显慢于FBX08干扰组。裸鼠的尾静脉体内转移实验结果显示:两种细胞株均在肺脏表面可见明显的转移灶,SW480/MOCK组中裸鼠出现肺脏转移率为100%(6/6);SW480/FBXO8组中裸鼠出现肺脏转移率为66.7%(4/6);SW620NC组中裸鼠出现肺脏转移率为66.7%(4/6);SW620Si3组中裸鼠出现肺脏转移率为100%(6/6)。以上结果显示:FBXO8抑制结直肠癌细胞株的体内成瘤及转移。2.FBXO8在结直肠癌侵袭、转移中作用机制探讨2.1 FBXO8对mTOR的泛素化降解(1)利用 Western blot 检测 SW480/MOCK、SW480/FBXO8 细胞中 Akt/mTOR信号通路及靶基因的表达变化,结果显示:与SW480/MOCK组相比,SW480/FBXO8组中Akt、p-Akt蛋白表达无明显变化,但mTOR、p-mTOR、P70S6K、P-P70S6K蛋白表达水平明显降低。(2)利用MG-132处理结直肠癌细胞株SW620及乳腺癌细胞株MCF-7,Western blot结果显示:MG132处理后,2种细胞株中mTOR、P-mTOR蛋白的表达上调。(3)利用MG-132处理结直肠癌细胞株SW480/FBXO8,Western blot结果显示:MG132处理后,细胞中mTOR、P-mTOR蛋白的表达上调。(4)FBXO8对mTOR的泛素化降解检测试验在进行中。2.2 FBXO8与mTOR的相互作用检测(1)利用激光共聚焦显微镜观察SW480/MOCK与SW480/FBXO8细胞中FBX08与mTOR共定位情况,结果显示:FBXO8与mTOR定位于癌细胞胞浆,且SW480/FBXO8组中FBX08与mTOR共定位处荧光明显强于SW480/MOCK。(2)利用 CO-IP 实验检测 SW480/MOCK 与 SW480/FBXO8 细胞中 FBX08与mTOR结合情况,结果显示:FBXO8与mTOR存在直接结合作用。(3)构建 FBXO8 的两段截短子 FBX-Sec7(1132-1700a)和 FBX-1(851-1247a),利用CO-IP检测其与mTOR分子的结合,结果显示FBX-Sec7区域能与mTOR结合。(mTOR截短子部分实验正在进行中)2.3 FBXO8通过泛素化mTOR调控结直肠癌增殖和侵袭利用Rapa(雷帕霉素)处理结直肠癌细胞株SW620Si3,利用MTT比色法对SW620Si3细胞的体外增殖能力变化进行检测,Boyden侵袭小室观察SW620Si3细胞株的体外侵袭能力变化。结果显示:Rapa处理后SW620Si3细胞增殖速度明显下降;体外侵袭能力减弱。以上结果显示:FBXO8对结直肠癌侵袭和转移的抑制是通过泛素化降解mTOR作用的。结论1、FBXO8具有抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。2、提出一个新的调控机制,即FBXO8通过泛素化降解mTOR抑制结直肠癌侵袭和转移。