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研究背景肝脏持续受损时,肝星状细胞(hepatocyte stellate cell, HSC)的激活是引起纤维化的始动因素。一系列细胞因子和细胞信号转导通路组成信息网络使HSC活化、高表达α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, a-SMA),最终细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成增多导致肝脏发生纤维化。核转录因子-κB (nuclear factor kappaB, NF-κB)家族是具有多向转录激活功能的蛋白,存在于多种细胞中。其可能通过调控肝细胞、HSC以及枯否细胞的增殖、活化参与肝纤维化的发生发展。导师刘立新等发现并证实胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin-like growth factor binding protein related protein1, IGFBPrP1)是一种新的致肝纤维化因子。其中腹腔注射、植入式胶囊渗透压泵、腺病毒转载IGFBPrP1可选择性引起肝脏纤维化。为此,本实验将腺病毒包装的IGFBPrP1通过尾静脉注射进大鼠体内,观察肝组织中NF-κB p65的表达变化,探究NF-κB信号通路是否参与IGFBPrP1致肝纤维化的过程。目的以腺病毒为载体将胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(adenovirus insulin-like growth factor binding protein related protein1, Ad-IGFBPrP1)基因转入大鼠体内,探讨IGFBPrP1对大鼠肝组织中NF-κB p65的表达影响及意义。方法32只健康雄性6周龄SD大鼠随机分为4组,每组8只。正常对照组(尾静脉注射生理盐水)、阴性对照Ad-EGFP组(尾静脉注射腺病毒包装的增强型绿色荧光蛋白Ad-EGFP,4×109pfu/只，1次), Ad-IGFBPrP12周组(尾静脉注射Ad-IGFBPrP1,4×109pfu/只,1次)、Ad-IGFBPrP14周组(尾静脉注射Ad-IGFBPrP1,4×109pfu/只,1次)。各组分别于注射腺病毒2周、4周末乙醚吸入麻醉大鼠,分离肝左叶,用10%中性福尔马林固定,石蜡包埋、切片。采用HE染色观察4组肝组织病理变化情况；苦味酸一天狼星红染色观察各组肝组织中的胶原纤维含量的变化；免疫组织化学染色观察各组肝组织中IGFBPrP1、肝星状细胞活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, a-SMA)、 NF-κB p65及细胞外基质中纤维连接蛋白(fibronectin, Fn)的分布及表达变化情况。结果1.大鼠肝脏组织形态学变化(HE染色与苦味酸-天狼星红染色结果)正常对照组及阴性对照Ad-EGFP组的肝组织中小叶结构完整,肝索排列整齐,肝细胞胞浆饱满,无炎症、坏死等病理改变。在血管壁可见纤细的胶原纤维:Ad-IGFBPrP12周组中肝细胞脂肪变性,炎性细胞浸润,少见肝细胞坏死、凋亡；Ad-IGFBPrP14周组脂肪变性的肝细胞、炎性细胞及肝细胞核碎裂、溶解、消失增多,肝小叶结构不清,肝索紊乱,纤维条索形成。中央静脉及汇管区的胶原纤维显著增多,肝血窦中出现胶原纤维沉积,中央静脉之间伸出索状纤维。2.大鼠肝脏组织免疫组织化学染色结果(1)IGFBPrP1:正常对照组及阴性对照Ad-EGFP组中IGFBPrP1少量地表达在中央静脉的血管内皮、极少的肝细胞及汇管区,染色淡；在Ad-IGFBPrP12周组中,中央静脉血管壁、中央静脉周围的肝细胞、汇管区以及肝血窦的窦周隙中可见棕黄色颗粒大量分布,染色较深,4周组中的纤维条索周围也可观察到染色较深的颗粒。(2) NF-κBp65:正常对照组及阴性对照Ad-EGFP组中NF-κB p65仅表达于中央静脉周围的个别肝细胞胞质中,着色较淡；Ad-IGFBPrP12周组中阳性颗粒主要分布于肝窦隙、变性的肝细胞、纤维化区,随着IGFBPrP1在大鼠体内表达时间的延长,Ad-IGFBPrP14周组中除上述地方表达外,细胞核中也可见表达,染色较2周组加深,呈棕黄色。(3) α-SMA:在正常对照组及阴性对照Ad-EGFP组仅见于汇管区,染色较淡。Ad-IGFBPrP1组中汇管区及纤维化区均可见α-SMA大量表达,染色深,且随IGFBPrP1在大鼠体内表达时间的延长而加深。(4) Fn:Ad-IGFBPrP1组中Fn在中央静脉周围以及纤维化区沉积增多,可见大量且着色深的颗粒表达,4周组表达明显多于2周组。正常对照组及阴性对照Ad-EGFP组中仅在个别肝细胞中可见。3.苦味酸-天狼星红染色统计分析结果胶原面积百分比指数经平方根反正弦转换后,Ad-IGFBPrP12周组6.36±1.64,Ad-IGFBPrP14周组8.02±1.61VS正常对照组1.78±0.38,阴性对照Ad-EGFP组2.03±0.76, P均<0.01。 Ad-IGFBPrP14周组中胶原面积百分比明显高于2周组,P<0.01。4.大鼠肝脏组织免疫组织化学染色统计结果与正常对照组及阴性对照Ad-EGFP组相比,IGFBPrP1、 NF-κBp65, α-SMA及Fn在Ad-IGFBPrP1组的表达均显著性增强。各项IOD值统计结果如下：(1)IGFBPrP1:Ad-IGFBPrP12周组1.41±0.43,4周组4.93±0.18VS正常对照组0.21±0.06,阴性对照Ad-EGFP组0.25±0.07,P均<0.01。(2) NF-κBp65: Ad-IGFBPrP12周组3.66±1.59, Ad-IGFBPrP14周组4.39±1.47VS正常对照组0.02±0.02,阴性对照Ad-EGFP组0.16±0.13,P均<0.01。(3) a-SMA: Ad-IGFBPrP12周组2.23±0.99, Ad-IGFBPrP14周组4.11±0.21VS正常对照组0.11±0.07,阴性对照Ad-EGFP组0.12±0.06,P均<0.01。(4)Fn:Ad-IGFBPrP12周组1.68±0.34, Ad-IGFBPrP14周组5.66±2.81VS正常对照组0.002±0.001,阴性对照Ad-EGFP组0.04±0.06,P均<0.01。除此之外,这四项指标在Ad-IGFBPrP14周组中的IOD平均值较Ad-IGFBPrP12周组的结果明显高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论(1) Ad-IGFBPrP1经尾静脉注射成功转染进入大鼠,引起肝组织中NF-κB p65表达增高,最终导致肝组织发生纤维化。(2) IGFBPrP1致肝纤维化的机制之一可能通过NF-κB信号转导通路实现。