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蛋白质的聚乙二醇(PEG)修饰能够赋予蛋白质新的功能和特性,促进蛋白质的工业化应用,近年来得到了广泛而深入的研究。其中,蛋白质的PEG定点修饰更具优势,该策略避免了随机修饰的盲目性,在保留蛋白质构象及活性的基础上实现对蛋白质的特异性修饰。目前,相关报道已有很多,但开发出特异性高、反应速率快、修饰度高的PEG定点修饰蛋白质技术一直是该领域的研究热点。本课题提出了一种具有仿生粘附特性的邻苯二酚衍生化PEG用于实现蛋白质定点修饰的策略。以脂肪酶为研究对象,利用邻苯二酚基团与蛋白质表面的巯基之间的优先反应活性,结合蛋白质定点突变技术,实现了PEG对脂肪酶的理性定点修饰,并研究了PEG链长及修饰位点对脂肪酶构象及酶学性质的影响。研究内容包括以下几个方面：1、采用两条反应路线对不同分子量的PEG进行邻苯二酚官能化修饰,产物为DP5k、DTP5k、DTP12k及DTP20k,通过1H-NMR进行结构鉴定,表明接枝成功。2、在前期研究的基础上,通过对变形杆菌属脂肪酶(Proteus sp.K107)蛋白质晶体结构剖析,设计了两个突变位点,分别是靠近脂肪酶活性中心的“盖子结构”(T138C)和背离活性中心的无规则卷曲区域(Q201C),并通过定点突变技术获得了相应的突变株。3、考察了邻苯二酚结构官能化PEG对LipK107及其突变蛋白的修饰活性,并进一步研究了反应时间、温度及pH对修饰活性的影响。确定了最佳的修饰反应条件为pH7.4,25℃,在此条件下反应3h,DTP5k实现了对Q201C和T138C的特异性修饰,修饰率高达100%。4、通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质免疫印迹法、凝胶排阻高效液相色谱及飞行时间质谱技术对修饰反应效果进行鉴定,表明邻苯二酚结构官能化PEG对含有半胱氨酸的蛋白质具有特异性修饰作用。5、通过圆二色谱分析,表明PEG的链长和修饰位点对修饰前后脂肪酶构象未产生明显影响。通过考察修饰前后脂肪酶的水解活力及稳定性,表明不同链长PEG修饰前后酶的水解活力得到了很好的保留,DTP5k对脂肪酶的修饰能显著提高酶的热稳定性及酸碱耐受性。总之,本文所研究的新型官能化聚乙二醇,可用于蛋白质的定点修饰,并且对蛋白质的构象及活力没有影响,该方法新颖、易操作,可以进行广泛应用。