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黄酮类物质是植物次生代谢产物,具有多重生理功能和药用价值。大豆黄酮由大豆黄酮合成酶(编码基因为大豆黄酮合成酶基因GmFNSIIs,包括GmFNSII-1和GmFNSII-2),催化大豆黄烷酮而合成。正常条件下,大豆黄酮含量较低,其生物合成与植物抗逆有关。与大豆黄酮生物合成相关的代谢途径基因已经克隆得到,而诱导及调控其生物合成的分子机理有待进一步深入研究。本研究结果表明茉莉酸甲酯,甘露醇,葡萄糖和氯化钠均能诱导大豆黄酮合成酶基因表达和黄酮在大豆根、茎和叶中产生。克隆大豆黄酮合成酶基因启动子,连接GUS基因,转化大豆毛状根获得组合苗,在以上四种处理条件下,转基因毛状根中β-葡萄糖醛酸酶(GUS)活性均有不同程度显著提高,其中连接基因GmFNSII-1启动子(proGmFNSII-1)的GUS活性受茉莉酸甲酯诱导上调幅度最大,而甘露醇能显著诱导基因GmFNSII-1和GmFNSII-2两个启动子(proGmFNSII-1和proGmFNSII-2)活性。启动子proGmFNSII-1和proGmFNSII-2序列上存在与胁迫响应相关的顺式作用元件,启动子5’端缺失分析发现,茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA)突变后降低了启动子proGmFNSII-1对茉莉酸甲酯的响应效果;渗透胁迫响应区段的存在和糖抑制响应序列的缺失均有助于启动子proGmFNSII-2对葡萄糖响应,表明葡萄糖作为渗透因子(正调控)和糖信号分子(负调控)诱导基因GmFNSII-2表达。基因GmFNSIIs的mRNA表达及黄酮合成在大豆GmFNSIIs-RNAi转化根中受到抑制;氯化钠胁迫处理3天后,GmFNSIIs-RNAi组合苗相比对照,转化毛状根中丙二醛和过氧化氢类物质含量显著增加,胁迫2周后组合苗生物量显著降低,表明GmFNSIIs表达及黄酮含量影响大豆氯化钠胁迫抗性。大豆转录因子数据库进行GO分析得到123个与苯丙氨酸代谢相关的转录因子。茉莉酸甲酯处理大豆幼苗24小时后,对123个基因的表达谱研究发现,叶中63个基因表达量上调(51%),14个下调(11%);根中84个基因表达提升(68%),6个下降(5%),其中在根叶中有44个基因同时发生显著变化。分析44个基因在其他处理(水杨酸,蔗糖和大豆根瘤菌USDA110)的大豆根中表达情况,从中选出表达差异显著的14个基因,成功克隆到其中8个转录因子。酵母单杂交分析发现,四个转录因子(TF54,TF62,TF88和TF100)具有转录激活活性。基因GmMYB100(TF100)编码R2R3_MYB转录因子,原核表达得到蛋白大小和预测一致(26.16 kDa)。GmMYB100转录因子R3结构域上存在保守氨基酸基序[D/E]LX2[R/K]X3LX6LX3R,参与MYB转录因子和bHLH蛋白之间的互作,在C端存在保守性氨基酸基序pdLNLD/EL(与植物黄酮类物质生物合成负调控相关),推断GmMYB100与植物类黄酮负调控相关。基因GmMYB100在大豆叶片,花及幼胚发育早期表达量高,其蛋白具有转录激活活性,定位在细胞核中。在GmMYB100-OE转基因大豆毛状根中,部分大豆黄酮合成相关基因(GmCHS7,GmCHS8,GmCHI,GmIFS1和GmF3H)的表达量相比对照显著降低,大豆异黄酮含量降低,而大豆黄酮含量没有显著变化。而GmMYB100-RNAi的转基因大豆毛状根中,部分大豆黄酮合成相关基因(GmCHS7,GmCHS8,GmCHI,GmFNSII-1和GmF3H)的表达量相比对照升高,大豆异黄酮和大豆黄酮含量显著提升。在转基因拟南芥GmMYB100-OE中,拟南芥黄酮醇合成部分相关基因(AtCHS,AtCHI,AtF3’H,AtF3H,AtDFR2和AtFLS)的表达量相比对照都显著下降,转基因拟南芥中黄酮醇含量显著降低。烟草瞬时表达试验发现,基因GmMYB100过量表达抑制大豆黄酮合成相关基因GmCHS7和GmCHI启动子活性,但是激活GmF3H,GmFNSII-1和GmANS基因启动子,表明基因GmMYB100负调控部分黄酮合成相关基因的启动子。本研究证实R2R3-MYB转录因子GmMYB100负调控黄酮合成相关基因的表达。综上所述,在大豆黄酮受胁迫诱导生物合成过程中,大豆黄酮合成酶基因启动子proGmFNSII-1上顺式元件(CGTCA)响应茉莉酸甲酯的诱导,启动子proGmFNSII-2顺式元件影响了葡萄糖对黄酮合成诱导时产生渗透作用和糖信号因子两个作用。大豆黄酮含量和耐盐性相关,对于改善大豆耐盐性方面具有重要作用。同时鉴定到转录因子GmMYB100,其负调控大豆黄酮合成相关基因表达,影响黄酮生物合成。