第一部分S1P对Ⅱ型肺泡上皮细胞发生间质转化生物学效应的观察背景和目的肺间质纤维化是各种不同病因所致的肺间质疾病的共同结局,也是呼吸衰竭的重要原因之一,其主要表现为肺泡单位结构紊乱,病理改变以大量的成纤维细胞聚集、细胞外基质沉积（ECM）并伴有炎症损伤所致的结构破坏为特征。其发病机制极其复杂,涉及的网络系统及参与调控的信号分子众多。其中,大量研究已经证实肺泡上皮间质转化（EMT）在肺间质纤维化形成和进展过程中发挥着重要的生物学作用。EMT是指具有极性的上皮细胞在各种因素作用下转化成为间质表型的成纤维细胞或肌成纤维细胞的过程,并参与肺间质损伤后纤维化形成过程。近年研究发现,具有生物活性的鞘脂类1-磷酸鞘氨醇（S1P）在组织纤维病灶表达明显升高,可通过多种信号转导途径促进组织EMT形成介导其纤维化形成。研究涉及S1P对A549细胞发生EMT的生物学效应的观察,分析S1P是否通过EMT而参与到肺间质纤维化形成过程中。方法体外培养A549细胞株并进行分组:（1）阴性对照组:不施加干预因素;（2）S1P处理组(10^-8,10^-7,10-6,10^-5mol/L作用时间72h);（3）10^-5 mol/L S1P处理组（作用时间12、24、48、72h）。相差显微镜观察各组细胞形态学改变,并采用Western Blot和RT-PCR法检测α-SMA,FN,E-cad蛋白和m RNA的表达情况。结果1、细胞经不同浓度S1P孵育后,相差显微镜观察到自10^-7mol/L起细胞形态开始发生变化,细胞与细胞之间连接变得疏松,且随着浓度的增加,细胞逐渐拉长,由类圆形变成梭型,呈现成纤维细胞样改变。2、Western Blot和RT-PCR法均显示,与阴性对照组相比,S1P处理组,随S1P作用浓度及时间的累积间质标记分子α-SMA,FN的蛋白及m RNA表达明显升高（P<0.05）,但上皮标记分子E-cad的表达显著降低（P<0.05）。结论S1P在体外以浓度和时间依赖的方式诱导细胞发生EMT,这可能是促进间质纤维化形成和进展的关键作用机制。第二部分 S1P与TGF-β1通过SPHK1/S1P_2-3轴偶联介导EMT形成背景和目的S1P的合成与分解代谢受到鞘氨醇激酶（SPHKs）及鞘氨醇裂解酶（S1PL）等众多酶的调控,生成的S1P可与G-蛋白偶联受体（GPCRs）结合激活一系列的信号转导分子触发相应的分子网络系统从而调控EMT形成。事实上,S1P的分子网络系统也可与其他的细胞因子的网络系统相偶联,共同发挥相应的生物学效应。转化生长因子（TGF-β1）是一类具有多种生物学活性的细胞因子,是促进肺间质纤维化形成,发生和进展的经典因子,且主要通过依赖Smad和非依赖Smad途径来诱导EMT形成来调控肺间质纤维化形成。本研究的目的在于比较S1P与TGF-β1生物学效应及探讨TGF-β1是否通过受体（S1PRs）及相关酶类参与到S1P网络系统。方法1、S1P与TGF-β1生物学效应的比较。细胞分组:（1）阴性对照组:不施加干预因素;（2）TGF-β1组（阳性对照组）:5ng/ml孵育72h;（3）S1P组:10^-5 mol/L孵育72h。免疫荧光分析α-SMA和E-cad蛋白的表达情况;Western Blot和RT-PCR法检测α-SMA,FN,E-cad蛋白和m RNA的表达情况。2、S1P介导EMT的S1PRs分析。细胞分组:（1）阴性对照组:不施加干预因素;（2）S1P处理组（阳性对照组）:10^-5 mol/L S1P孵育72h;（3）W146组:W146（10-6mol/L）+S1P(10^-5 mol/L);（4）JTE013组:JTE013（10-6mol/L）+S1P(10^-5mol/L);（5）CAY10444组:CAY10444(10^-5mol/L)+S1P(10^-5 mol/L)。作用时间分别为30min,72h。Western Blot和RT-PCR法检测α-SMA,FN,E-cad蛋白和m RNA的表达情况。3、探索S1P是否通过与S1PRs结合发挥促TGF-β1分泌和表达效应。细胞分组同上。ELISA检测各个组的TGF-β1的分泌情况;Western Blot和RT-PCR法检测TGF-β1蛋白和m RNA的表达情况。4、分析TGF-β1与SPHKs之间的关系。细胞分组:（1）阴性对照组:不施加干预因素;（2）TGF-β1处理组（0.5,2,5,10ng/ml,72h）。Western Blot检测SPHKs蛋白表达情况。5、分析TGF-β1是否通过S1PRs介导EMT反应。细胞分组:（1）阴性对照组:不施加干预因素;（2）TGF-β1组（阳性对照组）:5ng/ml TGF-β1孵育72h;（3）W146组:W146（10-6mol/L）+TGF-β1（5ng/ml）;（4）JTE013组:JTE013（10-6mol/L）+TGF-β1（5ng/ml）;（5）CAY10444组:CAY10444（10--5mol/L）+TGF-β1（5ng/ml）。作用时间分别为30min,72h。RT-PCR检测α-SMA,FN,E-cad的m RNA表达情况。结果1、与阴性对照组相比,免疫荧光,Western Blot和RT-PCR检测到S1P组α-SMA和FN蛋白及m RNA的表达显著增强（P<0.05）,E-cad的表达却明显减弱（P<0.05）。与TGF-β1组相比,S1P组上皮及间质标记分子的表达并无显著变化（P>0.05）。2、Western Blot和RT-PCR显示,与阳性对照组相比,JTE013组和CAY10444组α-SMA和FN蛋白及m RNA的表达显著减弱（P<0.05）,E-cad的表达明显增强（P<0.05）。W146组的各个上皮及间质标记分子的表达并无明显差异（P>0.05）。3、ELISA,Western Blot和RT-PCR显示,与阳性对照组相比,JTE013组和CAY10444组TGF-β1分泌量,蛋白及m RNA的表达显著减弱（P<0.05）,而W146组TGF-β1分泌量,蛋白及m RNA却无明显变化（P>0.05）。4、Western Blot显示TGF-β1呈剂量依赖性升高SPHK1蛋白的表达,在此浓度范围内未检测出SPHK2明显升高。5、RT-PCR结果显示,与阳性对照组相比,JTE013组和CAY10444组α-SMA和FN的m RNA的表达显著减弱（P<0.05）,E-cad的表达明显增强（P<0.05）。W146组的各个上皮及间质标记分子的基因表达并无明显差异（P>0.05）。结论1、S1P可经典细胞因子TGF-β1发挥相类似的促EMT形成的生物学效应。2、S1P是通过S1P_2-3发挥EMT效应,机制可能包括S1P_2-3介导促进TGF-β1分泌,上调TGF-β1表达扩大S1P信号系统。3、TGF-β1呈剂量依赖性升高SPHK1的表达,而阻断S1P_2-3抑制了TGF-β1诱导A549细胞发生的EMT,其机制可能与S1P与TGF-β1通过SPHK1/S1P_2-3轴偶联共同调控EMT形成。