论文部分内容阅读
目的通过体外建立大鼠胸主动脉血管内皮细胞（Rat Thoracic Aortic Endothelial Cell,RTAEC）氧化应激模型,探讨枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharide,LBP）对氧化应激诱导的内皮功能障碍的保护作用及潜在的分子机制。方法CCK-8法检测不同浓度血管紧张素-Ⅱ（Angiotensin-Ⅱ,AngⅡ）(10-9、10-8、10-7、10-6、10`（-5）mol/L)处理RTAEC不同时间（3、6、12、24、48h）以及LBP（400、800、1600、3200、6400μg/mL,2h）干预对RTAEC相对活力的影响;荧光显微镜和流式细胞术检测AngⅡ(10-6mol/L,24h)处理和LBP干预（3200μg/mL,2h）对细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）的影响;蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测AngⅡ(10-6mol/L,24h)处理和LBP（400、3200μg/mL,2h）干预对RTAEC中紧密连接蛋白occludin、ZonulaOccludens-1（ZO-1）及内皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）、磷酸化的内皮生长因子受体（Phosphorylated Epidermal Growth Factor Receptor,p-EGFR）、酪氨酸激酶受体2（Human Epidermal Growth Factor Receptor-2,ErbB2/HER2）、磷酸化的酪氨酸激酶受体2（Phosphorylated Human Epidermal Growth Factor Receptor-2,p-HER2/p-ErbB2）、磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）、蛋白激酶B（Protein Kinase B,PKB/AKT）、磷酸化的蛋白激酶B（Phosphorylated Protein Kinase B,p-PKB/p-AKT）、内皮型一氧化氮合酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase,e-NOS）、磷酸化的内皮型一氧化氮合酶（Phosphorylated Endothelial Nitric Oxide Synthase,p-e-NOS）表达的影响;免疫荧光法（Immunofluorescence,IF）检测AngⅡ（10-6mol/L,24h）处理和LBP（400、3200μg/mL,2h）干预对occludin、ZO-1、EGFR、ErbB2的表达变化的影响;RT-qPCR检测AngⅡ(10-6mol/L,24h)处理、LBP（400、3200μg/mL,2h）干预及阻断剂AC480（2μmol/L,26h）、渥曼青霉素（Wortmannin,WM）（5μmol/L,26h）对细胞中EGFR、ErbB2、AKT、e-NOS基因表达的影响。采用SPSS 22.0统计软件包对数据进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差（sx±）表示,计数资料采用中位数±四分位数间距（QM±）表示,两组间比较采用正态分布资料的t检验（Student’s t test）,多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA analysis）,组内两两比较采用LSD法。结果与正常对照组比,用AngⅡ处理RTAEC后,细胞相对活力随AngⅡ浓度及培养时间的增加逐渐降低,且细胞相对活力在AngⅡ浓度为10-6mol/L培养24h后降到最低（P<0.05）;细胞内ROS水平在AngⅡ（10-6mol/L）处理24h后明显升高（P<0.05）;此外,AngⅡ（10-6mol/L,24h）处理可以使细胞中紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达明显下调（P<0.05）,破坏细胞膜完整性。如果事先给予LBP干预可以逆转AngⅡ导致的这些改变使血管内皮细胞的相对活力升高,显著降低细胞内ROS的水平（P<0.05）,使紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达上调而维持细胞膜的完整性。AngⅡ（10-6mol/L,24h）处理还可以使细胞中EGFR、p-EGFR表达上调,LBP干预可以使它们表达下调。但是AngⅡ（10-6mol/L,24h）处理会使细胞中ErbB2、p-ErbB2、PI3K、p-e-NOS（P<0.05）、p-AKT（P<0.05）表达下调,而事先给予LBP干预可以使它们表达上调。AngⅡ和LBP对EGFR和ErbB2基因表达的影响与AngⅡ和LBP对它们蛋白表达的影响相同（P<0.01）。AngⅡ和LBP对p-e-NOS、p-AKT表达的影响可以被PI3K的特异性阻断剂WM阻断但是不能被EGFR和ErbB2的选择性阻断剂AC480阻断。AC480仅仅能阻断ErbB2在Tyr1248位点的磷酸化。结果表明:AngⅡ、LBP、WM和AC480基本不影响e-NOS和AKT总蛋白及mRNA的表达。结论LBP可以通过调节酪氨酸激酶受体EGFR、ErbB2的总蛋白和磷酸化蛋白表达水平以及信号通路PI3K/AKT/e-NOS中AKT、e-NOS的磷酸化蛋白表达水平来改善氧化应激诱导的内皮功能障碍。