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心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌肌原纤维中细肌丝上收缩调节蛋白中的抑制亚基,参与了心肌收缩中粗细肌丝的相对滑行。在心肌损伤、心肌梗死等心血管疾病的诊断过程中发挥了重要的作用。cTnI作为心肌梗死的“金标准”,已广泛应用于临床诊断中,同时,低浓度水平的cTnI变化同其他心血管疾病有一定的相关性。目前针对cTnI常用的检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、金标免疫法等。这些方法大多基于抗体的特异性识别,且难以对痕量物质进行检测。因此,建立具有更高灵敏度和更好准确性的cTnI检测方法具有重要的研究意义和应用价值。针对抗体合成修饰较难、成本较高的缺点,核酸适配体可以作为一种能够与靶分子特异性结合的核酸分子,具有亲和力高、特异性强、结合稳定、更容易修饰和制备的特性。另外,近年来,基于核酸分子可以扩增的特性,越来越多的研究将对蛋白的检测转换为对核酸的检测,通过扩增反应增加可检测的核酸靶标量,起到信号放大作用,从而达到对痕量物质进行检测的目的,如免疫聚合酶链式反应(Immuno-polymerase chain reaction,IPCR)、免疫滚环扩增反应(Immuno-rolling circle amplification,IRCA)、邻位连接技术(Proximity Ligation Assay,PLA)等。这些检测方法的灵敏度与特异性都明显高于传统的ELISA方法。本文拟基于核酸适配体对cTnI的特异性识别,采取滚环扩增(RCA)为信号放大方式,结合荧光探针等手段实现对cTnI的高灵敏定量检测。首先,建立了RCA反应体系,优化了反应中酶的种类、用量及反应时间,并以琼脂糖凝胶电泳为手段进行表征。结果表明,环化反应的最佳条件为10 U T4 DNA连接酶作为环化反应催化酶,反应时间为2 h;扩增反应的最佳条件为10 U phi 29 DNA聚合酶,反应时间为过夜。其次,选取了文献中报道的与目标蛋白cTnI具有高特异性和高亲和作用的两条核酸适配体序列,并设计合成了相应的适配体引物复合物。考察了适配体引物复合物和环化产物对cTnI的亲和力和特异性的影响。结果表明,环化反应后的产物不会对适配体特异性识别cTnI产生影响,同时,采用预先制备环化产物的方法,相较96孔板上进行的原位环化反应,可以减少实验时间。再次,设计合成了与RCA产物结合的分子信标探针,在验证其有效性的基础上,建立了基于核酸适配体特异性识别、RCA信号放大和分子信标检测的方法用于cTnI的定量检测,优化得到了线性范围、检测限、定量限,同时考察了相关物质的干扰和回收率。结果表明,该方法的线性范围为50–500 pg/mL,检测限为9.03 pg/mL,定量限为51.41 pg/mL;除此之外,检测方法稳定可靠,且具有很好的抗干扰能力,四种相关干扰物质肌红蛋白、人血清白蛋白、EDTA、葡萄糖均未对检测产生干扰,人血样本中cTnI标准样品的回收率在100%左右。然后,建立了基于氧化石墨烯传感器的检测体系,并与核酸适配体特异性识别和RCA信号放大相结合,建立了cTnI的定量检测方法。优化得到了线性范围、检测限、定量限,同时考察了相关物质的干扰和回收率。结果表明,该方法线性范围为25–500pg/mL,检测限为11.96 pg/mL,定量限为23.88 pg/mL。人血样本中cTnI标准样品的回收率在95%-105%之间。最后,对本研究中建立的两种灵敏的cTnI定量检测方法进行了比较,并与目前最常用的酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测结果进行了对比,结果表明,本文所建立的两种方法的灵敏度和回收率均优于目前商用的ELISA试剂盒。分子信标方法操作简便,但对探针的设计要求较高;石墨烯传感器方法的定量检测限与分子信标方法相当,但氧化石墨烯分子不均一的结构和电子性质使其能够可逆性的与生物分子结合,为传感器的构建提供一个平台,灵活性强,成本低廉。