论文部分内容阅读
目的:胃癌是世界第四大常见肿瘤,其死亡率在肿瘤相关死亡中位居第二。流行病学研究表明,压力、慢性抑郁症和缺乏社会关心可作为癌症发生和进展的风险因素,但其机制并不清楚。心理干预和免疫治疗已成为肿瘤综合治疗的重要内容,但由于缺乏有效的治疗靶点,临床心理干预的疗效尚未达成共识。因此,深入研究心理应激引起胃癌发生发展的启动环节和调控途径,为应激相关胃癌的预防和治疗提供新的靶点,是急待解决的关键问题之一。本研究探讨了慢性应激在胃癌发生发展过程中的作用及机制,并进一步探讨阻断肾上腺素受体在胃癌治疗中的潜在价值,为应激相关胃癌的预防和治疗提供新的思路。方法:在N-甲基-N-亚硝脲（MNU）诱导小鼠自然形成胃癌模型的基础上,采用束缚小鼠行动来模拟慢性应激刺激,建立慢性应激参与胃癌发生的小鼠模型。将小鼠胃癌标本进行基因表达谱测序,初步筛查慢性应激促进胃癌发生的作用机制,并用定量PCR进行验证。检测DNA氧化损伤程度及DNA双链损伤（DSBs）程度,以及碱基切除修复途径的活性,来明确慢性应激对DNA损伤修复的影响;采用CCK-8法及平板克隆实验检测细胞增殖能力;通过流式细胞术及软琼脂失巢凋亡实验检测细胞抗凋亡能力;采用Transwell法检测胃癌细胞的迁移侵袭能力;采用小管形成实验检测去甲肾上腺素对胃癌细胞VEGF分泌的影响;Western Blot及免疫共沉淀检测参与作用的通路蛋白;应用裸鼠皮下及胃原位成瘤模型、肺转移模型,体内验证慢性应激的促增殖、转移作用;免疫组化法验证裸鼠移植瘤中相关信号分子的相互作用关系;TUNEL法检测裸鼠移植瘤凋亡水平。结果:在致癌剂MNU的诱导下,慢性应激明显增加小鼠胃癌的发生率。对小鼠胃癌样本进行基因表达谱测序分析发现,DNA损伤修复通路异常参与了慢性应激导致胃癌发生的过程。DHE流式检测发现慢性应激显著升高肿瘤细胞内的活性氧簇水平（ROS）,进一步检测DNA损伤标志物8-OHdG和γ-H2AX显示,慢性应激显著引起胃癌细胞DNA损伤。在机制研究中发现,β2肾上腺素受体（ADRB2）激活后,通过PKA-STAT3途径,抑制了碱基切除修复途径（BER）的关键基因XRCC1的表达水平。同时,还通过激活MDM2,增加了p53的泛素化,使p53降解,避免细胞因DNA损伤而发生凋亡。118例胃癌组织芯片结果证实,ADRB2与pSTAT3表达正相关,而与XRCC1表达负相关。采用裸鼠皮下移植瘤模型及胃原位移植瘤模型研究发现,慢性应激及介导应激反应的神经递质去甲肾上腺素能明显促进胃癌移植瘤的生长、转移、血管形成。进一步通过免疫共沉淀及免疫荧光检测发现,去甲肾上腺素通过激活Src,进而使E-cadherin/β-catenin复合体分离,导致β-catenin游离并入核启动下游基因的转录。通过CCK-8法发现,Carvedilol、Propranolol及Butoxamine对胃癌细胞的半数抑制浓度IC50在他们的生理治疗浓度范围内（1-100μM）。三种阻滞剂能明显增加胃癌细胞对多西他赛Docetaxel、长春新碱Vincristine及表阿霉素Epirubicin的敏感性。蛋白芯片检测凋亡相关因子发现,联合处理组细胞内HSP70、Survivin、XIAP及Bcl-w表达受到抑制。结论:慢性应激能明显促进胃癌的发生及发展,阻断应激过程的关键信号通路可能成为治疗胃癌的新靶点。