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研究目的1.探究高糖对人皮肤成纤维细胞的影响,建立高糖老化成纤维细胞模型。2.探索人胎盘蜕膜间充质干细胞培养上清液（placenta decidua mesenchymal stem cell conditioned media,d MSC-CM）对高糖老化成纤维细胞的影响。3.明确蜕膜间充质干细胞源细胞外小囊泡（placenta decidua mesenchymal stem cell derive small extracellular vesicles,d MSC-s EVs）对高糖老化成纤维细胞的影响及其机制。4.建立糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型,探究d MSC-s EVs对糖尿病创面的影响及其机制。研究方法1.取人包皮组织分离培养成纤维细胞,实验分组:NG组（Normal glucose,含5.5 m M葡萄糖的DMEM）,HG1组（High glucose 1,含26 m M葡萄糖的DMEM）,HG2组（High glucose 2,含35 m M葡萄糖的DMEM）。分别于1、3、5和7 d用CCK-8试剂盒检测细胞增殖率;划痕实验检测细胞迁移情况;DCFH-DA探针检测细胞内活性氧簇水平;细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测各组β-半乳糖苷酶活性;各组培养7 d后用western blot检测p21表达情况。2.取足月自然分娩产妇胎盘分离d MSCs,鉴定后传代培养至第5代,加入含或不含s EV抑制剂GW4869的培养基培养2 d后收集d MSC-CM。然后将高糖老化的成纤维细胞分为3组:HG2,HG2+d MSC-CM,HG2+d MSC-CM+GW4869。各组培养3d后,观察细胞增殖率和迁移情况。3.差速高速离心法从d MSC-CM中分离d MSC-s EVs,并用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析技术和western blot进行鉴定,囊泡内化实验观察d MSC-s EVs对细胞的作用方式。将高糖老化的成纤维细胞分为5组:HG2,HG2+d MSC-s EVs1.74×1011 particles/m L,HG2+d MSC-s EVs 3.48×1011 particles/m L,HG2+d MSC-s EVs 5.22×1011 particles/m L和HG2+d MSC-s EVs 6.92×1011particles/m L。各组培养3 d后,观察细胞增殖率、细胞周期、迁移情况、细胞内活性氧簇水平、β-半乳糖苷酶活性;用western blot检测Ⅰ型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白表达情况,观察d MSC-s EVs对高糖衰老成纤维细胞分化的影响;DCFH-DA探针检测细胞内活性氧簇水平;细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测各组β-半乳糖苷酶活性,western blot检测p21表达情况,观察d MSC-s EVs对高糖衰老成纤维细胞细胞内活性氧簇水平和衰老细胞数量的影响。Western blot检测RAGE信号通路关键蛋白RAGE及其下游蛋白p21 RAS,Smad信号通路蛋白磷酸化Smad 2/3表达情况,明确d MSC-s EVs修复高糖衰老成纤维细胞的机制。为明确Smad信号通路作用,高糖老化的成纤维细胞中提前加入磷酸化Smad 2/3抑制剂SB431542培养,实验分为3组:HG2,HG2+d MSC-s EVs,HG2+d MSC-s EVs+SB431542,western blot检测磷酸化Smad 2/3的表达情况,同时观统计各组衰老细胞数量。4.在糖尿病小鼠背部建立全层皮肤缺损创面,在创缘周围注射等体积d MSC-s EVs和磷酸盐缓冲溶液治疗,统计两组创面愈合率。取术后7、14、21和28 d创缘皮肤组织,用苏木精和伊红染色法进行组织学观察并统计创面愈合率,马松染色观察创缘胶原沉积情况。免疫荧光染色观察增殖细胞核抗原、趋化因子受体CXCR4、α-平滑肌肌动蛋白、p21表达情况,明确d MSC-s EVs修复糖尿病创面的机制。结果1.CCK-8细胞增殖实验和划痕实验结果显示,35 m M高糖环境可显著降低成纤维细胞的增殖能力和迁移能力。DCFH-DA探针检测结果显示,35 m M高糖环境显著提高了细胞内活性氧簇水平。β-半乳糖苷酶染色结果显示,35 m M高糖环境可诱导产生更多的衰老细胞。Western blot结果显示,在培养7 d时35 m M高糖环境显著上调细胞p21的表达。2.从胎盘蜕膜分离的细胞倒置显微镜下观察呈梭状;经流式细胞仪鉴定,该细胞高表达CD90、CD73、CD105,低表达或不表达CD19、CD45、CD34和HLA-DR。定向诱导分化实验结果显示,d MSCs可诱导为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。CCK-8细胞增殖实验和划痕实验结果显示,d MSC-CM可显著提高高糖老化成纤维细胞增殖及迁移能力。然而加入GW4869后,d MSC-CM促进成纤维细胞增殖和迁移的作用明显减弱,提示d MSC-CM中s EVs可能是修复高糖老化成纤维细胞的主要因素。3.透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析结果显示,从d MSC-CM中分离的细胞外囊泡直径符合小囊泡直径;Western blot结果显示该囊泡可表达CD9、CD63、CD81、TSG101,不表达Grp94,可确定该粒子属于细胞外小囊泡。该小囊泡可内化进入成纤维细胞内从而发挥作用。CCK-8细胞增殖实验、细胞周期检测结果显示,d MSC-s EVs可显著促进高糖老化成纤维细胞进入S、G2/M期,从而促进细胞增殖;划痕实验结果显示,d MSC-s EVs可显著促进成纤维细胞迁移;Western blot结果显示,d MSC-s EVs可显著提高高糖老化成纤维细胞表达Ⅰ型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白,提示d MSC-s EVs可促进高糖衰老成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。d MSC-s EVs可显著减少高糖老化成纤维细胞内活性氧簇水平和衰老细胞数量。Western blot结果显示,d MSC-s EVs可减少高糖老化成纤维细胞p21表达。信号通路关键蛋白检测发现,加入d MSC-s EVs后,RAGE和其下游蛋白p21 RAS表达显著下降,同时磷酸化Smad2/3表达显著升高。为了验证Smad通路的作用,加入磷酸化Smad2/3抑制剂SB431542后,该组磷酸化Smad2/3表达显著下调,同时镜下观察衰老细胞数量明显增多,提示Smad通路在d MSC-s EVs修复高糖衰老成纤维细胞中起到关键作用。4.动物实验结果显示,d MSC-s EVs可加速糖尿病创面愈合,促进真皮胶原沉积。免疫荧光染色结果显示,d MSC-s EVs可促进创面真皮层高表达PCNA、CXCR4和α-SMA,同时抑制p21表达,提示d MSC-s EVs可促进成纤维细胞增殖、迁移和分化,减缓成纤维细胞的衰老,从而促进创面愈合。结论本研究首先明确了高糖诱导成纤维细胞衰老的条件,建立了高糖老化成纤维细胞模型。然后明确d MSC-s EVs能够促进高糖老化成纤维细胞增殖和迁移能力,减少细胞内活性氧簇水平及衰老细胞数量,这些现象与抑制RAGE通路、激活Smad通路密切相关。最后发现d MSC-s EVs能够加速糖尿病创面愈合,其机制是通过促进创缘真皮成纤维细胞增殖、迁移、分化,减少细胞衰老。本研究为今后探究d MSC-s EVs应用于临床糖尿病慢性创面治疗提供了扎实的理论基础。