论文部分内容阅读
目的及意义 血吸虫病（Schistosomiasis）为世界性分布、危害严重的人畜共患的寄生虫病。血吸虫（Schistosoma）在吸虫中独特的雌雄异体形式，使得雌雄虫在生殖生理方面表现出复杂的功能差异。雌雄合抱是血吸虫雌虫性成熟的前提，而雌虫性成熟产卵又是主要致病因素。因此，控制血吸虫性成熟生殖是防制血吸虫病的重要关键，其中对血吸虫性别特异性基因及其功能的研究，已引起了研究者广泛重视。这些研究不仅对阐明血吸虫发育及生殖机理具有重要理论意义，而且对抗血吸虫生殖免疫及研制有效防治新药也具有重要的实践意义。但总体来讲，该领域的研究积累尚少，所获得的基因数量有限，对其功能的研究则有待深入。尤其是对国内流行的日本血吸虫中国大陆株的研究更需要展开。本研究以研究日本血吸虫性别特异性基因及其功能为主要目的，从分析比较日本血吸虫中国大陆株雌雄虫之间蛋白质组成的差异性入手，鉴定雌雄虫特异性蛋白质；以此为线索克隆日本血吸虫性别特异性基因并对其免疫保护功能进行较为系统的研究，为从分子水平上揭示血吸虫性别发育、成熟及其生殖机制和探索防制新途径莫定一定的基础。 方法及结果 首先分别利用SDS-PAGE和双向电泳技术对日本血吸虫中国大陆株雌雄成虫虫体蛋白质进行分析研究。软件分析SDS-PAGE结果显示，有2处（79kDa、43kDa）雄虫蛋白质相对含量明显高于雌虫，另有4处（35kDa、28kDa、25kDa、22kDa）雌虫蛋白质的相对含量明显高于雄虫；双向电泳分析进一步查明了血吸虫雌雄虫蛋白质组成的诸多差异。在43kDa，pI5.60-5.90处雄虫有一条长度和宽度均超过雌虫，由多个斑点连在一起组成的条带；雌虫则有7个特有斑点（38kDa，pI5.71；38kDa，pI5.65；35kDa，pI5.7O；35kDa，pI5.58；32kDa，pI5.72；22kDa，pI5.45；18kDa，pI5.40处）；在28kDa，pI6.90-7.35处，雌雄虫各有3个斑点，但雄 虫较雌虫的斑点大；在28kD左右，pl4．80乃．50处，有许多斑点组成的着 色区，但雌虫的着色程度较雄虫深得多。该项研究揭示了日本血吸虫雌 雄虫之间虫体组成蛋白质明显的差异性，为开展血吸虫性别特异性基因的 研究积累了有益基础。 SDS－PAGE及双向电泳结果在43kD处蛋白质显示雌雄差异。以此为． 线索，检索查得编码曼氏血吸虫肌动蛋白的 CDNA（ShactZ夕，据此设 计一对引物，以日本血吸虫中国大陆株成虫InRNA为模板，用RT．PCR 扩增出一 11 31 hP的 CDNA片段。测序结果表明该片段为编码日本血吸虫 肌动蛋白基因的完整阅读框 CDNA，与 ShaCtZ cDNA序列同源性为 92％，命名为SjAct。将其克隆到表达载体pET28atO，在大肠杆菌中获 得了高效表达，SDSIAGE分析估计表达产物（伽ct）分子量约43kDa。用 兔抗日本血吸虫成虫粗抗原血清进行Western印迹分析，在预测位置出现 了明显的识别条带，说明咖Ct具有良好的抗原性。用巾Ct免疫昆明系 小鼠，攻击血吸虫尾抱，7周后剖杀小鼠，进行成虫和虫卵计数，其减虫一 率为28．40，肝脏减卵率为29．2O，和对照组比较，P刃．05差异显著，显示 了血吸虫肌动蛋白一定的免疫保护功能。 SDS．PAGE结果还显示在约79all处雄虫蛋白质的相对含量高于雌 虫，检索查得曼氏血吸虫 CDNA片段（SmGC），该片段编码曼氏血吸虫 抱雌沟分泌蛋白质79kDa肽段。根据SmGCP保守区片段设计一对引物， 以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板，用RT．PCR法扩增出一大 小为868hp的基因片段。经测序证明该片段为编码日本血吸虫抱雌沟蛋 白基因保守区的。DNA，与SmGCP相应片段碱基同源性86石％，命名为 SjGCPj，编码的氨基酸序列同源性为 84．l％。将其克隆到表达载体． pET28归中，在大肠杆菌中获得了较高量的表达，SDS｛AGE分析估计表 达产物（均GCP八分子量约 29kD。利用兔抗日本血吸虫成虫粗抗原血 清进行 Western检测，在预测位置出现了明显的识别条带，说明 TSjGCPI 2 具有良好的抗原性。用TSjGCP］免疫昆明系小鼠，攻击尾蛐，7周后剖杀 小鼠，进行成虫和虫卵计数，其减虫率为35．2％，肝脏减卵率为37．8％，与 对照组比较，Pm刀5差异显著，表明血吸虫抱雌沟蛋白具有一定的免疫保 护功能。 为进一步研究 SjGCP］的核酸免疫特性，将其克隆到真核表达载体’ PCDNA3中，得到的重组质粒直接免疫昆明系小鼠，设不含 SjGCP］的 pCDNA3质粒为对照以进行效果比较。自免疫开?