塞内卡谷病毒（Seneca valley virus,SVV）属于小核糖核酸病毒科塞内卡谷病毒属的唯一成员,与心病毒属成员的遗传关系最近。2002年研究学者从被认为是人胚胎视网膜细胞（PER.C6）培养物的污染物中分离得到SVV,2007年首次报道了猪群SVV感染与猪特发性水疱病（Porcine idiopathic vesicular disease,PIVD）相关,随后陆续在美国、巴西、中国、泰国、哥伦比亚和越南等国家也有SVV感染的报道。在临床上,感染的猪只表现为跛行,水疱并伴有精神沉郁、厌食和发热等症状,新生仔猪病死率约30%-70%。作为猪的新发传染病病原,SVV与宿主细胞相互作用以及感染致病机理等均不清楚。病毒感染细胞后可以导致细胞不同途径的死亡,如自噬和凋亡等。细胞凋亡（apoptosis）是多细胞生物调控机体发育,维持内环境稳定,由基因调控的细胞主动死亡过程,属于I型细胞程序性死亡。而病毒感染诱导哪种类型的细胞死亡在其致病过程中起着至关重要的作用。有文献报道SVV可以诱导细胞凋亡,我们实验室前期研究显示SVV非结构蛋白2C参与诱导细胞凋亡。此外,SVV能够选择性地感染和裂解具有神经内分泌特征的肿瘤细胞,已经作为溶瘤病毒用于治疗小细胞肺癌。SVV与肿瘤细胞上ANTXR1分子有强烈的亲和力,但是与正常细胞上相似的受体分子不能发生相互作用,其特异性地靶向具有神经内分泌特性的肿瘤细胞的分子机制尚不清楚。鉴于此,本研究从结构生物学和病毒学等方面解析SVV与受体ANTXR1相互作用的分子细节以及SVV 2C蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,这些研究对于阐明SVV与宿主细胞相互作用和感染致病的分子机理奠定基础,为SVV的抗病毒药物、新型疫苗和溶瘤病毒等生物制剂的研制提供理论基础,具有重要的科学意义和潜在的应用价值。具体内容如下:1.SVV与受体ANTXR1相互作用的分子细节将大量培养的SVV/HB-CH-2016（简称为SVV-HB）毒株超速离心浓缩,经过蔗糖梯度离心和氯化铯梯度离心纯化后与纯化的受体蛋白ANTXR1-v WA在体外进行结合,通过冷冻电镜技术分别对SVV以及SVV-ANTXR1-v WA复合物的结构进行解析,预测SVV VP1蛋白的第63位苏氨酸（T63）、第88位精氨酸（R88）、第94位丝氨酸（S94）和第98位丝氨酸（S98）以及VP2蛋白的第166位天冬氨酸（D166）、第177位丝氨酸（S177）、第181位酪氨酸（Y181）、第182位酪氨酸（Y182）、第183位精氨酸（R183）、第186位天冬酰胺（N186）和第187位色氨酸（W187）是SVV和ANTXR1相互作用的关键位点。为了确定预测的位点,我们在感染性克隆p SKII-CMV-SVV/HB-CH-2016的基础上对这些位点进行定点突变（均突变为丙氨酸）,将上述构建成功的SVV突变体质粒转染293T细胞,36-48h后可观察到类似SVV感染的细胞病变效应。通过Western blot和RT-PCR对突变体分别进行鉴定,结果表明成功拯救获得SVV的突变体SVV-VP1-T63A、SVV-VP1-R88A、SVV-VP1-S94A、SVV-VP1-S98A、SVV-VP2-D146A、SVV-VP2-D166A、SVV-VP2-S177A、SVV-VP2-Y181A和SVV-VP2-N186A。各个突变体的生长曲线结果显示,与SVV-HB的增殖趋势相似,SVV突变体感染6 h后开始大量复制,病毒滴度都随着时间的延长而增加;其中将SVV VP2的第177位的丝氨酸突变为丙氨酸后,在感染BHK-21细胞24 h后病毒滴度（3.25×10~9PFU/m L）与亲本毒株SVV-HB（2.12×10~9PFU/m L）相比有明显的增加,表明SVV VP2的第177位的丝氨酸可能对SVV与受体的结合起关键作用。在上述基础上,为了进一步确定SVV-VP2-S177A的生长特性,分别用1.0 MOI的亲本毒株SVV-HB与突变体SVV-VP2-S177A感染BHK-21细胞,噬斑实验表明SVV-VP2-S177A感染细胞形成的噬斑明显变大,直径约为0.3-0.5 cm,而野毒株噬斑大小约为0.1-0.2 cm;而且用不同的感染复数感染BHK-21细胞后发现,尤其在感染后期,SVV-VP2-S177A的病毒滴度明显提高。随后对SVV-VP2-S177A和SVV-HB的热稳定性进行了比较,结果显示两者都在52℃和84℃发生解离;同时利用透射电镜观察SVV-VP2-S177A和SVV-HB在不同p H条件下的病毒粒子形态,结果显示两者在相同p H下的病毒颗粒都很完整,形态均一呈圆形,粒子大小相似,直径约为27 nm。以上结果表明将VP2 177位的丝氨酸突变为丙氨酸后不影响病毒对酸和热的稳定性。用免疫沉淀实验和His-pull down实验分析了SVV-VP2-S177A和ANTXR1的结合特性,结果显示,SVV-VP2-S177A组的ANTXR1-v WA蛋白均可以钓取SVV VP1蛋白,表明SVV-VP2-S177A可以与受体ANTXR1发生相互作用。最后我们通过冷冻电镜技术解析了SVV-VP2-S177A和SVV-VP2-S177A-ANTXR1-v WA复合物的结构,结果显示与SVV-HB的结构相比,SVV-VP2-S177A的构象无明显变化,但SVV-VP2-S177A与ANTXR1-v WA结合的结构可以看出SVV-VP2-S177A与ANTXR1-v WA相互作用增强,综上结果表明SVV-VP2-S177A的结构比SVV-HB更稳定,也为构建SVV新型疫苗和抗病毒药物设计提供理论基础。2.SVV 2C蛋白诱导细胞凋亡的机制研究实验室前期研究显示SVV非结构蛋白2C参与诱导细胞凋亡,本研究首先通过Annexin V-FITC/PI和Western blot实验确定SVV 2C蛋白能诱导293T细胞凋亡,Annexin V-FITC染色结果显示293T细胞中过表达SVV 2C蛋白能增加凋亡细胞的荧光信号,Western blot检测显示SVV 2C蛋白可以导致PARP1的切割,并呈剂量依赖性。为了确定SVV 2C蛋白诱导细胞凋亡的关键位点,构建了SVV 2C基因A基序和B基序保守位点突变的质粒,进而通过Western blot检测2C不同突变质粒转染细胞后对PARP1切割的影响,结果显示2C基因A基序和B基序保守位点的改变并不影响2C蛋白对PARP1的切割,表明2C蛋白诱导的细胞凋亡与这些保守的基序无关。进而构建2C基因的不同截断体:N端结构域（1-102AA）,AAA结构域（103-243AA）和C端结构域（244-323AA）,Western blot结果显示N端结构域,AAA结构域和C端结构域单独存在的情况不能导致PARP1的切割,而N端结构域分别与AAA结构域或C端结构域共同存在的情况下可以导致PARP1的切割,表明N端结构域可能是2C蛋白诱导细胞凋亡的关键结构域。为了进一步阐明SVV 2C蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,确定2C蛋白参与细胞凋亡的具体途径,检测了细胞中2C蛋白对caspase酶活性的影响。结果显示2C蛋白可以激活caspase-9和caspase-3;Western blot检测了caspase-3蛋白的表达情况,结果显示2C蛋白可以导致caspase-3的活化,切割成17 KDa的蛋白;同时在广谱caspase抑制剂（Z-VAD-FMK）的存在下,Western blot检测结果显示Z-VAD-FMK可以减弱2C蛋白导致的PARP1的切割,上述结果表明2C蛋白诱导的细胞凋亡是通过线粒体介导的内源性途径完成的。为明确2C蛋白通过线粒体途径诱导凋亡的细节,我们将表达2C蛋白的细胞进行细胞质蛋白和线粒体蛋白的分离。Western blot检测结果显示2C蛋白仅在线粒体部分有表达,并且可以促进细胞色素C（Cyt c）释放至胞质中。随后通过激光共聚焦实验验证了2C蛋白定位在线粒体上。因为Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的相互作用维持了线粒体的平衡,为了寻找2C蛋白的靶蛋白,通过免疫沉淀实验,2C成功钓取到抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2。通过CO-IP实验验证了2C蛋白仅和Bcl-xL发生相互作用。通过竞争CO-IP实验确定2C蛋白对线粒体平衡的影响,结果显示2C的加入并不影响Bcl-xL与促凋亡蛋白Bak和Bax的互作,表明Bcl-xL和2C蛋白互作的区域与Bcl-xL和Bak和Bax的互作区域不同。同时构建Bcl-xL基因的不同截断体,CO-IP实验结果显示Bcl-xL蛋白的C末端区域（196-232AA）和2C蛋白发生相互作用。综上结果表明,SVV 2C定位于线粒体,通过靶向Bcl-xL的C末端区域（196-232AA）,即暴露出跨膜区,引起Bak和Bax在线粒体膜上的聚集,增加线粒体膜的通透性,导致Cyt c释放到细胞质,激活caspase-3,进而诱导细胞凋亡。