目的:1.确定灶周水肿的性质，评价不同干预措施对脑出血灶周损伤的影响；2.探讨凝血酶在脑出血的炎性损伤机制中的作用；3.分析血管淀粉样变相关的脑出血的临床特征和脑出血的病因；4.探讨基底节区脑出血患者的运动功能障碍与神经纤维的完整性之间的关系。 材料与方法: 一、乳猪脑出血的灶周水肿与神经元损伤的实验研究 1.乳猪的自体血脑叶出血模型：体重8-12kg的小猪，术前6h禁食，4h禁饮。肌肉注射氯胺酮15mg/kg、阿托品0.02mg/kg，待动物麻醉后俯卧位固定在手术台上。参考Wagner等的方法建立猪右侧额叶出血模型。 2.动物分组乳猪28头，随机分为5组(3、6、12、24和48h)。各组于相应时间点完成MR检测后，快速放血断头取脑，留标本。其中凝血酶组与出血模型步骤相同，4例局部注入凝血酶500u；手术引流组在模型造好后0.5h行MRI检查，于1-5h以18G的留置针插入血肿内以空针负压抽吸，并以生理盐水冲洗置换之。 3.磁共振检查在动物模型成功后分别在0.5、3、6、12、24、48h和72h行动态MRI检查，序列T1、T2、T2、T2*、DWI、FLAIR、MRS。于磁共振工作站以eFilm软件盲法分析图片，由磁共振专科医师盲法进行乳酸含量的定性分析。 4.各组于相应时间点完成MR检测后，快速放血断头取脑，留标本。 5.主要试剂Bax原位杂交试剂盒，TUNEL试剂盒。 6.透射电镜检查德国Zeiss公司产EM10C透射电镜。不同时间点新鲜脑组织迅速取0.5-1mm3组织块，经戊二醛及锇酸固定液固定后按常规电镜样品制备程序脱水、渗透、包埋、超薄切片、铀铅染色，进行电镜观测。 7.末端标记原位细胞凋亡检测(TUNEL)常规步骤进行，阳性标准：胞核呈蓝色为凋亡阳性细胞。 8.Bax基因的原位杂交常规步骤进行，阳性标准：细胞胞浆着色呈棕黄色。 9.图像分析切片经光镜观察后采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统定量分析，每张切片于200倍镜下由专业技师随机选取5个视野，测量凋亡和Bax基因表达阳性细胞的数量、平均细胞面积和平均吸光度。 二、临床部分 1.脑组织来源为2001年3月至2004年12月本院神经内科住院的原发性脑出血患者，行微创血肿引流治疗。共206例，男132例，女74例，年龄34～97岁；血肿量35-144ml。其中93例术中获得血肿周围抽吸出的脑组织。13例术中注入低分子肝素500IU加0.9％生理盐水2mL血肿周围，4h后再抽吸血肿，其中6例患者获得脑组织。分别留取肝素注入组和非肝素注入组术中抽吸出的血性液收取5ml，于术后第4天收取引流物5ml，分别以3000rpm离心10分钟后分离上清液。 2.脑组织取材方法采用北京万特福科技公司生产的YL-1型颅内血肿穿刺针。以CT片为依据于治疗室行简易立体定向血肿穿刺术。术中如有抽出的脑组织，选取新鲜的组织块迅速以多聚甲醛固定后以石蜡包埋。 3.组织病理学观察取脑片进行常规HE染色(在10×20倍光镜下观察)、噬银染色、刚过红染色和免疫组化检测。 4.刚果红染色采用Freudenthal改良刚果红染色法[1]，以盲法由病理医生光镜下读片。阳性标准：微小血管壁内呈鲜红色，细胞核呈蓝色。 5.免疫组化：常规步骤进行，鼠抗β淀粉样前体蛋白多克隆抗体，生物素标记羊抗兔IgG。检测肿瘤坏死因子的表达。阳性标准：以神经纤维或微小血管内膜呈棕褐色为Aβ蛋白表达。 6.双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测获得的引流液中IL-6、IL-10的浓度。 7.银染采用Bielschowsky氏改良染色法。 8.脑出血患者的功能磁共振基底节区脑出血患者25例，随机分为两组，分别行单纯药物治疗和联合微创颅内血肿清除术，于2周内及恢复期以张量弥散成像检测皮质脊髓束的损伤程度、以功能磁共振检测运动皮层的激活范围与强度，并与恢复期运动功能障碍评分作相关分析。 结果: 1.脑出血后0.5h血肿周围出现高信号区，而此时DWI未发现异常。动态MRI序列提示出血后灶周水肿在48h达高峰，对照组0.5、3h水肿程度轻，手术组的水肿高峰较血肿组延迟。 2.Bax阳性细胞数于24h达高峰，凋亡阳性细胞计数24h达高峰，3h与6h之间无显著性差异，Lac峰主要出现在24、48h组，在3-6h患侧和3h健侧则未检测出，NAA/Cr呈渐降趋势，电镜显示3-6h灶周神经元损伤较轻，于24-48h损伤较重。 3.普通组较肝素干预组的中性粒细胞计数多，TNF-a阳性表达细胞计数两组无统计学差异，干预组术中与术后第三天相比IL-6、IL-10浓度比较差异有显著性。 4.62例脑组织中7例(11.3％)脑片刚果红染色阳性，较Aβ蛋白免疫组化检测阳性率低(25.8％)。刚果红染色阳性率随着年龄增加呈升高趋势，无性别差异，与血肿量和再出血无关，有高血压病史较无高血压者低，脑叶出血者高；Aβ蛋白阳性分布与性别、年龄、高血压病史、血肿量和出血部位之间均无统计学意义。 5.多元方差分析急性期与恢复期得分有统计学差异，但手术组与药物组间没有差异。急性期与恢复期得分间的相关分析(R=0.89862，P=0.0002)。轻残组和重残组于恢复期分别进行fMRI测试，瘫痪轻的患者恢复期执行对指运动，RMI、RPMC、SMA、LMI、LPMC均有激活，以RMI、LMI明显，瘫痪较完全的患者执行针刺多个皮质功能区激活。 结论: 1.脑出血超早期灶周水肿的发生与血块收缩有关，延迟发生的灶周水肿与凝血酶的毒性有关，超早期血肿抽吸引流术能减轻细胞毒性脑水肿。 2.脑出血急性期灶周继发性神经元凋亡、神经元损伤与代谢障碍在3-6h内较轻，在24-48h明显加重。为减轻继发性损伤，宜尽早采取有效的干预措施。 3.脑出血后血肿周围存在炎症损伤机制，局部运用肝素能降低炎症细胞因子表达，凝血酶可能是脑出血的炎症反应启动原因之一。 4.血管淀粉样变相关的脑出血无性别差异，与无高血压病史有关，易发生脑叶出血。Aβ蛋白免疫组化检测缺乏特异性，不宜用于病因诊断。 5.脑出血患者联合应用DTI、fMRI能够检测白质纤维束的损伤程度，评估预后。 研究总结:本研究实验部分以注入自体血乳猪脑叶出血模型为基础，以1.5T磁共振的EPI软件的多种序列对脑出血的水肿演变、水肿性质和血肿周围组织的代谢进行系列研究，并结合灶周组织分子生物学、组织形态学改变，提出超早期灶周水肿的发生与血块收缩有关，延迟发生的灶周水肿与凝血酶的毒性有关，超早期血肿抽吸引流术能减轻细胞毒性脑水肿；脑出血急性期灶周继发性神经元凋亡、神经元损伤与代谢障碍在3-6h内较轻，在24-48h明显加重。 临床研究部分以获得的脑组织进行刚果红染色、组织免疫组化等检查，分析血管淀粉样变相关脑出血的临床特点，证明脑出血后血肿周围存在炎症损伤机制，局部运用肝素能降低炎症细胞因子表达，凝血酶可能是脑出血的炎症反应启动原因之一。同时，首次以功能磁共振结合弥散张量成像对基底节区脑出血患者的运动功能障碍与神经纤维束的损伤进行了开拓性研究。