Nitric oxide（NO）系统在脊椎动物的神经内分泌免疫调控网络中发挥着不可或缺的作用，它既能作为免疫系统的效应部分，直接参与入侵病原的清除，又能作为神经系统的重要类型，通过神经内分泌免疫调控网络内的相互作用来调节机体的免疫应答水平。目前发现，NO系统在无脊椎动物中同样发挥着重要的作用，能参与调节无脊椎动物的生长、发育、学习、记忆、行为及免疫等生理活动。但无脊椎动物NO系统的组成特征，及其在神经内分泌免疫调控网络中的作用的相关研究还十分有限。本研究采取分子、细胞生物学等手段，初步查明了贝类NO系统的分子组成和基本特征，明确了贝类NO系统与神经内分泌系统的相互作用方式，进而确定了NO系统在神经内分泌系统调控下对扇贝免疫应答的调节作用。从栉孔扇贝中克隆获得了一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）基因CfNOS。它的cDNA全长为5023bp，编码一条1486个氨基酸组成的多肽链。CfNOS含有PDZ、氧化型和还原型3个结构域，后两个结构域由CaM结合位点连接。通过基因组序列的信息学分析，在太平洋牡蛎中仅发现一个NOS基因CgNOS。体外扩增CgNOS N末端、C末端及中间位置结构域的cDNA序列，均获得单一的扩增条带。除了卵母细胞和受精卵，CfNOS mRNA转录本在扇贝个体发育的各个阶段均能检测到，并在性腺、外套膜、肝胰腺、肾脏、鳃、肌肉和血淋巴细胞中呈组成型表达。利用2种结构域特异性抗体OxFMN-Ab和PDZ-Ab分别检测CgNOS在血淋巴细胞膜和细胞浆中的表达，发现CfNOS蛋白同时存在于血淋巴细胞膜和细胞浆中，并且具有2-3种不同大小的蛋白形式。利用CfNOS抗体进行免疫沉淀，获得CfNOS天然蛋白后，检测其催化活性为30.31±0.26U mgprot-1。分别加入nNOS和iNOS的抑制剂Spd和SMT后，CfNOS天然蛋白的活性显著降低，而eNOS的抑制剂L-NAME对其无影响。PAMP（sLPS、PGN和β-glucan）或TNF-α的刺激使扇贝血淋巴细胞中CfNOSmRNA的表达水平显著上升，且对后者的应答更为迅速。LPS和SMT的共刺激降低了LPS诱导产生的NO含量和NOS活性、血淋巴上清的抗菌活性、血淋巴细胞的吞噬活性和呼吸爆发水平，增强了血淋巴细胞的凋亡水平、血淋巴上清中的谷胱甘肽含量和超氧化物歧化酶活性，并恢复了溶菌酶和酚氧化酶的活性。LPS和TNF-α的共刺激使部分CgNOS从牡蛎血淋巴细胞膜转位到细胞浆中，其中发生磷酸化修饰的CgNOS也表现出同样的趋势。Pull down实验发现CgNOS与PSD-95蛋白存在相互作用。LPS刺激栉孔扇贝原代血淋巴细胞后，NO和norepinephrine（NE）的浓度都显著上升，其中NE的响应更为迅速和持久。LPS与NE/α-adrenoceptor（AR）激动剂共刺激时，NO含量显著低于LPS单刺激时的含量，而与β-AR激动剂共刺激时，NO含量继续显著升高；LPS与α/β-AR激动剂共刺激时，胞内cAMP水平显著低于LPS单刺激时的水平，与β-AR激动剂共刺激时胞内Ca2+水平也显著上升。NO供体SNP作用于原代血淋巴细胞时，胞内的NE浓度显著上升。利用LPS和TNF-α共刺激太平洋牡蛎12hr后，血淋巴细胞中CgNF-κB和CgSTAT等转录因子表达水平显著上升，而CgAP-1表达水平显著下降；Westernblotting结果显示在12-24hr之间，胞浆CgNF-κB1蛋白磷酸化修饰减弱且部分从胞浆转移到细胞核内，CgAP-1蛋白同时存在于细胞浆和细胞核中但其磷酸化修饰无显著变化；LPS和TNF-α共刺激24hr后，启动CgNOS转录的CgNF-κB1和CgSTAT活性显著增加。上述研究结果表明软体动物NO系统的组成不同于脊椎动物，但同样具有非常重要的生理学意义。贝类NOS尚未出现分型，其序列结构类似nNOS的特征，活性特征类似nNOS和iNOS，并拥有类似iNOS的免疫活性；贝类NOS仅存在一种mRNA转录本，但有多种蛋白表达形式。免疫刺激下，贝类儿茶酚胺能系统通过NE-α/β-AR-cAMP/Ca2+途径调控NO系统的活性水平，并通过NF-κB、STAT等转录因子调控NOS的转录和表达；部分NOS通过PSD-95蛋白锚定在内膜周边，免疫应答时从细胞膜转位到细胞浆内，以改变NO的合成速率；生成的NO参与了对贝类固有免疫应答反应的调控。