论文部分内容阅读
BAT（棕色脂肪组织）的动员和WAT（白色脂肪组织）的米色化已成为对抗肥胖和其他代谢性疾病的有希望的靶标,因为米色脂肪可以通过线粒体产生热量而消耗脂肪。通常,白色脂肪组织的棕色化（米色化）需要某些外部因素的刺激,例如长期受冷和荷尔蒙相互作用,这些刺激导致形成多叶脂滴、UCP1表达和线粒体数目增加,从而导致白色脂肪米黄色脂肪转化。尽管经典BAT具有主要的温度调节作用,但如果人体内过量的WAT能转分化米色脂肪将成为防止肥胖及代谢疾病的的更有前景的策略。线粒体生物发生在WAT的米色化过程中具有重要影响,其功能障碍最终导致对脂肪细胞能量代谢的有害作用。线粒体的转录和复制受细胞核编码基因的调控,然后该产物易位至线粒体。除了在外部生理刺激下诱导UCP1表达外,PGC1α（PPARycoactivatorl-α）,Polg（mtDNA聚合酶γ）也被激活以引发内部代谢的改变。这些PGC1α和Polg以及Nrf1、2（核呼吸因子1、2）,TFAM（线粒体转录因子A）和mTERF1（线粒体转录终止因子1）控制mtDNA的转录和复制,以增强线粒体生物发生与功能改变。通过激活这些转录因子或蛋白的表达,许多药物和天然药物已显示出可使WAT棕色化显着增加。生长激素（GH）不仅在生长发育中起着重要作用,而且还调节脂肪细胞的增殖和分化。据报道,GH抑制脂肪细胞分化,减少甘油三酸酯的积累,增加脂解作用,脂质沉积,其分泌减少与肥胖有关。通常,GH与GHR结合后,可以激活PI3K,MAPK和STAT5信号通路。然而,据报道STAT5b被GH特异性激活[21,22]。除此之外,各种研究表明,STAT5可以增加UCP1的表达,因此它直接或间接参与WAT的棕色化。但是,GH在米色脂肪形成中的分子机制仍不清楚。在这项研究中,我们假设GH可以通过增加线粒体的生物发生来诱导WAT向褐变/米色转化。方法1.培养3t3-L1前脂肪细胞,并在生长激素（GH）存在和不存在（对照）的情况下诱导分化,然后通过油红O染色测量脂质含量。2.培养3t3-L1前脂肪细胞并诱导分化成脂肪细胞,观察GH干预后,使用线粒体绿色荧光染料评估GH处理后线粒体的含量和分布。3培养3t3-L1前脂肪细胞并诱导分化成脂肪细胞,观察GH干预后,用Western blotting的方法检测UCP1和Cidea的蛋白表达水平。4.培养3t3-L1前脂肪细胞并诱导分化成脂肪细胞,观察GH干预后,通过Western Blot和实时荧光定量PCR检测线粒体调控因子（Polg,PGC1,,Tfam,PPARγ）关键调控因子的蛋白和基因表达。5.培养3t3-L1前脂肪细胞并诱导分化成脂肪细胞,在GH三种抑制剂PD98059（MAPK 抑制剂）,LY294002（PI3K 抑制剂）和 Lestaurtinib（JAK/STAT 抑制剂）处理后用GH干预,以观察这三种信号通路对GH所致线粒体生物形成分子表达的影响。6.构建基于CIDEA,Polg和PGC1启动子调控区的荧光素酶报道基因质粒,将每个报道基因质粒转染入Hepg2细胞24小时。然后用GH处理细胞,并通过双重荧光素酶测定试剂盒进行荧光素酶活性的测定。7.给C57BL/6J小鼠喂食高脂饮食数（12?）周,分为2组。一组根据其体重注射GH1个月,而另一组接受PBS。在治疗之前,之后和期间监测小鼠体重。8.处死小鼠,测量全身重量和脂肪组织重量。提取皮下和内脏脂肪组织并纯化样品,然后通过蛋白质印迹法测量蛋白质表达。结果1.在3t3-L1前脂肪细胞诱导分化成脂肪细胞过程中,经GH干预,呈现脂肪含量减少,线粒体增多的结果。也就是说GH干预后油红O染色强度降低和线粒体荧光染色增强。2.在3t3-L1前脂肪细胞诱导分化成脂肪细胞过程中,经GH干预,与对照组相比,细胞内UCP1和Cidea蛋白表达升高。3.在3t3-L1前脂肪细胞诱导分化成脂肪细胞过程中,经GH干预,细胞中Polg,PGC1α,Tfam,PPARγ的mRNA和蛋白水平升高;其他重要蛋白的表达也有所升高（如 Cytc,PDK2）。4.在分化的3t3-L1脂肪细胞用PD98059、LY2940和Lestaurtinib进行处理后再用GH刺激,结果显示:这些抑制剂对Polg和PGC1α的蛋白表达都有影响。5.在分化的3t3-L1脂肪细胞用Lestaurtinib处理后,GH所诱导的PPARy,Tfam和UCP1的表达也收到了抑制。6.荧光素酶分析结果表明,GH能增强CIDEA,Polg和PGC1α启动子的转录活性。7.与对照组相比,高脂饮食的小鼠经GH干预后,其体重明显降低。8.高脂饮食的小鼠经GH干预,其皮下和内脏脂肪组织中UCP1,Polg,PGC1a,Tfam的表达明显增加。结论1.这些结果表明,GH有将3T3-L1细胞转化成米色/棕色样脂肪细胞的趋势。2.GH治疗可增加3T3-L1脂肪细胞的线粒体数量3.GH干预可通过增加线粒体生物发生相关蛋白的表达而增加线粒体的数量,并改变线粒体的能量消耗。4.GH部分通过JAK/STAT途径影响线粒体关键调控因子的表达。5.与对照组相比,GH治疗可导致肥胖小鼠体重减轻和线粒体生物发生蛋白关键调节因子水平增加,从而证实了我们的体外研究结果;GH处理可通过线粒体生物发生赋予白色脂肪细胞米色脂肪的性质。