二十碳五烯酸协同长春瑞滨对A-549细胞作用研究

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目的:探讨二十碳五烯酸(EPA,Eicosapentaenoic Acid)以及联合长春瑞滨(NVB, Vinorelbine)对人肺癌A-549细胞株的增值和凋亡以及细胞周期的影响。方法:在体外培养肺癌A-549细胞株。实验一,分为对照组和实验组。对照组只加培养液,实验组用EPA60μg/mL的培养液培养细胞,采用了倒置显微镜、HE染色、AnnexinV-PI双染色荧光方法,在显微镜下观察人肺癌A-549肿瘤细胞的形态变化。实验二,分为EPA组、NVB组、EPA+NVB组。EPA组在15、30、45、60、75、90μg/mL,6个浓度下采用MTT比色法,测定第24、48、72小时的IC50值。NVB组在12、16、20、24、28、32μg/mL5个浓度下采用MTT比色法,测定第24、48、72小时的IC50值。EPA+NVB组采用了序贯用药方法,EPA和NVB的实验浓度均为各24h时IC50以下药物浓度,测定了联合用药后NVBIC50的变化及用等效线图解法观察两种药物对人肺癌A-549细胞株后的相互作用。实验三,分为六个组,分别为对照组、EPA15、30、60组、NVB组、EPA+NVB组,采用流式细胞仪检测各组对人肺癌A-549细胞株的胞凋亡情况以及细胞周期的影响。结果:①用倒置显微镜观察,发现实验组的A-549肿瘤细胞体积缩小、细胞呈圆形,染色质在细胞内聚集,细胞膜分割细胞形成凋亡小体,细胞之间连接松散,贴壁能力减弱。②HE染色:在倒置显微镜下,用EPA处理组的肺癌A-549细胞可见体积缩小,呈圆形,可见有的细胞染色质脱落,有的细胞膜分割细胞形成凋亡小体,也可见核染色质浓缩及染色质块形成。③AnnexinV-PI双染色肺癌A-549肿瘤细胞,在荧光显微镜下观察发现,实验组A-549肿瘤细胞细胞膜被染成绿色,细胞核染色质呈红色,并且细胞周围可见带绿色荧光的凋亡小体。④MTT实验结果表明:EPA在15μg/mL~90μg/mL范围内,于24、48、72小时对肺癌A-549细胞株均有抑制生长作用且与NVB有协同抗癌作用,并表现出浓度、时间依赖性关系。⑤流式细胞仪检测结果发现EPA联合NVB组的凋亡率较单用NVB组明显增加。⑥EPA终浓度在15μg/mL、30μg/mL、45μg/mL处理48h后,Go/G1期细胞百分比下降,S期细胞百分比上升,阻滞周期于S期。NVB浓度在15μg/mL处理48h后,G0/G1期细胞百分比下降,G2/M期细胞百分比上升,阻滞周期于G2/M期。联合应用EPA和NVB浓度在15μg/mL处理48h后,Go/G1期细胞百分比下降,S期和G2/M期细胞百分比上升,阻滞周期于S期和G2/M期。结论:1.经凋亡形态学分析,在体外实验中,EPA对人肺癌A-549细胞有诱导凋亡作用。2.体外实验中,EPA对人肺癌A-549细胞生长有抑制作用,呈明显的时间和剂量依赖性。3.EPA与NVB对人肺癌A-549细胞的抑制具有协同作用,与单用NVB相比,联合应用可减少NVB的用药剂量。4.流式细胞仪结果分析,EPA联合NVB组的凋亡率较单用NVB组明显增加。5.EPA有S期阻滞作用,NVB有G2/M期阻滞作用,这可能是EPA与NVB对人肺癌A-549细胞的抑制具有协同作用的机制之一。
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