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肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球常见的恶性肿瘤之一,且呈逐年上升之势,肝癌的治疗目前仍是以手术为主的综合治疗,但中晚期患者常失去手术机会。由于肝癌对化疗的不敏感,所以肝癌的化疗总体效果不佳。因此研究肝癌对化疗的不敏感性对提高肝癌的疗效以及提高病人生存率有很重要的意义。虽然目前对肝癌的耐药机制研究较多,但确切的机制仍不清楚。新近的研究表明,端粒酶可能和肿瘤的耐药有关。 端粒酶是一种核糖核蛋白酶复合物,负责将端粒重复序列(TTAGGG)添加到染色体未端,补偿了随细胞分裂而出现的端粒丢失,稳定了永生化细胞的端粒长度。端粒酶有三个成分组成,一种是功能性RNA(hTR)成分,它是合成端粒重复序列的模板,还有一种是端粒酶的催化亚基(hTERT),它有逆转录酶的活性。第三种是端粒酶结合蛋白。端粒酶RNA成分及相关蛋白在大多数组织中有表达,相反,端粒酶催化亚基在正常组织中是受抑制的,只有在永生化细胞和癌细胞上才上调;此外,在端粒酶阴性的细胞中导入hTERT即可检测到端粒酶活性,这说明hTERT的表达与端粒酶活性是平行的,hTERT的激活对肿瘤细胞中端粒酶活性的激活是“足够的和必须的”。所以在端粒酶的激活过程中,hTERT基因在细胞中的表达是决定端粒酶活性的限速步骤。在本实验室以前进行的肝癌端粒酶相关研究中,发现HCC的端粒酶阳性率为85%,明显高于癌旁组织、肝硬变组织及慢性肝炎组织,而正常肝脏组织不表达端粒酶活性,认为端粒酶的表达可能在HCC的发生发展中起到了关键的作用。在预实验中我们发现低浓度的化疗药物顺铂不但不能杀死肿瘤细胞,而且能上调端粒酶的活性及诱导肿瘤细胞对药物敏感性的降低。因此本实验的目的是:研究端粒酶活性上调在肝癌细胞对化疗药物不敏感性的作用。本实验主要由以下几部分组成: 1、低浓度化疗药物诱导肝癌细胞对药物不敏感 本实验部分利用低浓度(2μg/ml)的化疗药物顺铂处理肝癌细胞7721,在培养皿中诱导一周,随后用高浓度(10μg/ml)的顺铂同时处理相同数量的诱导的和未诱导的7721细胞24小时;利用MTT法检测细胞活性,在相差显微镜下观察细胞形态的变化,用PI染色、通过流式细胞仪来检测细胞凋亡,结果发现诱导过的肝癌细胞7721的存活率比未诱导的高,细胞出现变小、变圆和透亮等形态变化的也较少,凋亡率减少。本实验结果说明了药物诱导过的肝癌细胞7721比未诱导过