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【研究背景及目的】血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是血管内皮细胞(endothelialcell,EC)的前体。在组织缺血、损伤,外源性细胞因子以及药物的刺激下,骨髓中的EPCs可以被动员到外周血,迁移,归巢到血管新生部位,并在迁移部位增殖、分化成EC,形成新的血管。近年来的研究表明,EPCs在缺血性心脑血管病的发生、发展中发挥着重要角色,有关EPCs的研究成果为缺血性疾病打开了新的视角。血府逐瘀汤出自清代著名医家王清任的《医林改错》,该方活血而不耗血,祛瘀又能生新,是临床常用的活血化瘀的经典药方之一。临床上能改善微循环,治疗冠心病、血栓性静脉炎和视网膜静脉血栓等缺血性疾病。在以鸡胚绒毛尿囊膜作为模型的前期筛选实验中,本项目组发现血府逐瘀汤具有显著的促进血管新生的作用,为药物治疗缺血性疾病的临床应用提供了初步的理论基础。由于血管新生与EPCs直接相关,本课题通过观察血府逐瘀汤对EPCs结构、动员因子及对EPCs增殖、迁移、吞噬低密度脂蛋白(Dil-acLDL)、黏附、体外形成血管能力的影响,进一步明确血府逐瘀汤促进血管新生的作用。【实验方法】1骨髓EPCs的培养及鉴定无菌分离大鼠胫骨和股骨,DMEM培养基冲洗骨髓,采用密度梯度离心法提取单个核细胞,接种在明胶包被的培养皿中培养,DMEM培养液培养4天,洗掉非贴壁细胞,换培养液继续培养,通过流式细胞仪和免疫组化分析细胞表面标志CD31、CD34、flk-1(VEGFR-2)和vWF等的表达,倒置荧光显微镜鉴定Dil-acLDL染色阳性细胞,并进一步通过电镜观察EPCs的细胞结构。2血府逐瘀汤对EPCs动员、结构和功能的影响酶联免疫法测定血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),基质细胞源性因子-1(Stomal cell-derived factor-1,SDF-1),粒/巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF/Granulocyte monocyte-colonystimulating factor,GM-CSF)和促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)的含量,硝酸还原法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)含量。选11天原代贴壁细胞,随机分为12组:药物组高、中、低剂量血清与对照组血清,每组血清分为5%,10%,15%3个浓度,溶于含15%FBS的DMEM培养液中,分别培养24h、48h和72h,利用透射电镜、MTT比色法,Boyden小室、黏附能力测定实验和倒置荧光显微镜来观察药物对细胞结构、增殖能力、吞噬Dil-acLDL能力、迁移能力、黏附能力和体外形成血管的能力的影响。【实验结果】1 EPCs的培养及鉴定新分离的EPCs呈圆形,48h后开始贴壁,3天细胞出现集落,5天形成典型的线样排列,7天大部分细胞呈梭形,flk-1表达17.32%,11天时形成血管管腔结构,培养14天,贴壁细胞CD31、VEGFR-2(flk-1)和vWF均呈阳性表达,能够吞噬Dil-acLDL,透射电镜下能够看见粗面内质网、线粒体、高尔基体和溶酶体等细胞器。2血府逐瘀汤对EPCs动员的影响随着药物浓度的提高,血清中NO的浓度相应升高,呈明显的量效关系;与空白对照组血清相比,药物组血清高剂量VEGF的浓度升高,G-CSF的浓度下降,中剂量SDF-1,GM-CSF的浓度均上升,中、低剂量药物血清中,VEGF浓度降低。3血府逐瘀汤对EPCs结构的功能的影响高、中剂量的血府逐瘀汤能显著促进EPCs的增殖、吞噬、迁移、分化(结构)、黏附和体外形成血管的能力。【结论】1采用密度梯度离心法能够成功分离出大鼠骨髓内皮祖细胞。2血府逐瘀汤能够提高血清中VEGF、GM-CSF、SDF-1和NO等内皮祖细胞动员因子的浓度,其中对NO的影响呈量效关系。3血府逐瘀汤能够促进EPCs的增殖、吞噬、迁移、分化、黏附和体外形成血管的能力,其中高、中剂量的药物作用显著。4血府逐瘀汤具有诱导EPCs参与血管新生的作用,这可能是其临床治疗心、脑血管等缺血性疾病的机制之一。