血小板衍生因子C(PDGF-C)属于血小板衍生因子(PDGF)家族的一员。在正常细胞中PDGF-C仅有少量表达,而在癌症组织中,PDGF-C表达增加,且与肿瘤的增殖、转移密切相关。PDGF-C可介导细胞发生多种生物学行为,一般通过结合其受体PDGFα或β发挥生物学功能,有研究表明PDGF-C可以促进新生血管的形成,可促使肿瘤细胞发生转移和增殖。PDGF-C还是一类被大家所认可的可以激活成纤维细胞的细胞因子。在乳腺癌中,肿瘤组织中表达有大量的PDGF-C,且其表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关,而微环境中成纤维细胞上表达有PDGF-C的受体PDGFα和β,PDGF-C通过与其受体结合,激活受体,活化的受体导致酪氨酸激酶通路激活,介导成纤维细胞活化,参与多种细胞因子的分泌和细胞微环境的形成。越来越多的研究者认为肿瘤的增殖、转移及侵袭不仅取决于肿瘤细胞本身,而且取决于其所生长的微环境。肿瘤微环境由肿瘤细胞、内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞及细胞外基质等构成。在乳腺癌中,高转移性乳腺癌患者基质组织中存在大量的活化的成纤维细胞,又称癌相关的成纤维细胞(CAFs)。作为肿瘤微环境的重要组成部分,CAFs与乳腺癌的进展息息相关,CAFs可以分泌多种因子介导乳腺癌的发生、发展,促进乳腺癌的浸润、增殖和转移。研究者们广泛认同的如SDF-1/CXCR4(基质细胞衍生因子1/基质细胞衍生因子受体4)生物轴,SDF-1/CXCR4是CAFs分泌的重要因子,CAFs通过分泌SDF-1/CXCR4促进肿瘤的定向转移和血管的生成。CAFs还可以通过分泌其他因子来促进肿瘤的增殖和转移,如肝细胞生长因子的(HGF),表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(b FGF),胰岛素样生长因子(IGF)等。CAFs是正常的成纤维细胞经过一些特定的细胞因子的刺激,使之成为活化的成纤维细胞(CAFs)。因此阻断肿瘤微环境中CAFs的活化过程能阻断肿瘤的发展过程。PDGF-C通过与其受体结合介导成纤维细胞的活化,因此降低PDGF-C的表达也可阻止成纤维细胞的活化。基因序列编码的蛋白最终得以表达需通过转录和翻译等过程。由于转录和翻译的复杂性,使人类的基因表达调控系统也在多个层面异常复杂。其中基因表达调控非常重要的一个环节就是转录后水平的调节。转录后水平调节的最重要的调节点之一就是m RNA的稳定性。Hu R是研究的最为成熟的一种RNA结合蛋白,分布于与多种组织中,包括乳腺、脾脏等,Hu R通过于m RNA 3’UTR区的AU富集元件结合激活其功能,增强m RNA的稳定性。根据本实验组前期的研究发现在高转移性乳腺癌中表达有大量的Hu R,而低转移性乳腺癌中Hu R的表达水平较低,文献也有类似的报道。我们通过生物信息学分析发现在PDGF-C m RNA的3’UTR区存在5个AU富集元件,可能是Hu R的结合位点。构建PDGF-C m RNA的3’UTR区载体,转染入Hu R高表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,双荧光素酶基因报告系统检测发现Hu R可明显的增加荧光素酶基因的表达,且在第2个和第4个结合位点基因表达增长较明显,由此可知Hu R可作用于PDGF-C m RNA的3’UTR区调节PDGFC。在MDA-MB-231细胞中,通过si RNA降低Hu R的表达,用western blot技术检测在Hu R不同表达水平下PDGF-C表达水平的变化,研究发现利用si RNA降低Hu R的表达后,PDGF-C的表达也降低。说明Hu R可以调节PDGF-C的表达,且为正向调节。微小RNA(mi R)也是通过转录后水平调节来调节蛋白的表达。mi R是一类小的非编码RNA分子,贯穿癌症的整个发生、发展过程,多与原癌基因或抑癌基因相关。mi R一般通过结合靶基因m RNA的3’UTR区,降解靶基因的m RNA,从而降低靶基因编码蛋白的表达。本研究通过生物信息学分析找出可能作用于PDGF-C m RNA的3’UTR区的mi R,通过与PDGF-C m RNA的3’UTR的荧光载体共同转染入MDA-MB-231细胞中,培养48小时后,双荧光素酶基因报告系统验证有生物学功能的mi R,研究发现在分析软件分析出的17种mi R只有mi R-382-5p降低读数最明显;将mi R-382-5p类似物转染入MDA-MB-231细胞中,用western blot技术检测PDGF-C的表达变化,结果发现MDA-MB-231细胞转染入mi R-382-5p类似物后PDGF-C的表达降低。这就证明mi R-382-5p可以作用于PDGF-C m RNA的3’UTR区,降解PDGF-C的m RNA,使PDGF-C表达下调。同时我们利用RT-PCR技术检测恶性程度不同的两种乳腺癌细胞系MDA-MB-231与MCF-7细胞中mi R-382-5p表达情况,结果显示在转移性高的MDA-MB-231细胞中mi R-382-5p表达低,而在转移性低的MCF-7细胞中mi R-382-5p表达高,符合前面实验结果的逻辑。Hu R和mi R-382-5p都可以作用于PDGF-C的3’UTR区,且同时存在与乳腺癌肿瘤组织中。将乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞分为3组,第1组MDA-MB-231细胞正常培养,第2组给细胞内转染mi R-382-5p类似物,第3组转染Hu R的si RNA,western blot实验检测PDGF-C的表达差异。研究发现PDGF-C在第一组表达最高,第二组稍有降低,第三组显著降低,说明Hu R和mi R-382-5p都可在转录后水平调节PDGF-C的表达,且分别为正向和负向调节。在高转移性乳腺癌中,PDGF-C可激活肿瘤微环境中的成纤维细胞,进而促进肿瘤的增殖、转移。本研究设计一系列实验,发现RNA结合蛋白Hu R可作用于PDGF-C m RNA 3’UTR区,上调PDGF-C的表达,而mi R-382-5p可作用于PDGF-C m RNA 3’UTR区,但降低PDGF-C的表达。使我们对乳腺癌的增殖、转移调节机制的研究有了新的方向。