内皮依赖性超极化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor,EDHF)是由血管内皮产生的一种非一氧化氮、非前列环素途径的超极化因子,它通过诱导血管平滑肌细胞超极化而诱导血管舒张。EDHF是管径比较小的阻力血管主要的舒张因子,EDHF及其反应在不同种属、不同血管上也不径相同,至今脑血管中的EDHF物质基础仍然不清楚。本实验室前期研究提示 H2S与大鼠脑血管的EDHF反应有关,本课题在此基础上,采用大鼠在体 CSE基因沉默技术,通过血管舒张实验及血管平滑肌细胞超极化实验来研究确定了大鼠大脑中动脉和基底动脉中 EDHF与 H2S的关系。　　脑缺血性损伤在临床最为常见,但其发生发展的病理机制尚不完全清楚,关于 H2S在脑缺血损伤中的作用也未有定论。本课题采用 CSE siRNA转染大鼠及CSE基因敲除小鼠脑局灶性脑缺血再灌注模型,研究探讨内源性 H2S在脑缺血损伤中的作用,并且结合脑缺血损伤时脑血管的收缩功能和内皮依赖性舒张功能改变来研究H2S抗脑缺血损伤作用的机制。　　实验目的:　　1.研究探讨大鼠脑血管中 EDHF反应与 H2S的关系;　　2.研究确定大鼠脑血管中 EDHF物质基础是否为 H2S;　　3.确定内源性及外源性 H2S在脑缺血再灌注损伤中的作用;　　4.研究内源性 H2S对缺血性脑损伤大鼠大脑中动脉的血管收缩功能和舒张功能的影响。　　实验方法:　　1.采用离体血管舒缩功能测定法以及细胞内电位记录法,观察乙酰胆碱对正常大鼠大脑中动脉和基底动脉的舒张和超极化反应;合用 L-NAME和Indo抑制NO和PGI2的舒张和超极化反应后,观察大鼠大脑中动脉和基底动脉中是否存在 EDHF反应。　　2.采用 CSE siRNA在体转染技术,制备 CSE siRNA转染大鼠模型,用 western blot方法检测其脑血管中 CSE蛋白的表达,测定各组大鼠血浆 H2S的含量。　　3.应用 CSE siRNA转染大鼠,采用离体血管舒缩功能测定法以及细胞内电位记录实验方法,合用 L-NAME和Indo抑制 NO和PGI2的舒血管作用后,观察大鼠大脑中动脉和基底动脉中EDHF反应的改变。　　4.在 CSE siRNA大鼠中,采用 SKCa和IKCa通道抑制剂 charybdotoxin和apamin合用,观察 CSE siRNA大鼠大脑中动脉和基底动脉中残存的超极化和反应是否为 EDHF反应。　　5.在 CSE siRNA大鼠中,采用 PPG抑制残存 H2S,观察脑血管中残存的EDHF反应是否为 H2S介导的。　　6.采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,研究 NaHS抗脑缺血性损伤作用及其对缺血性损伤大脑中动脉的收舒缩功能和舒张功能的影响。　　7.制备 CSE siRNA大鼠脑缺血再灌注模型,通过神经功能评分、脑水肿、脑梗死体积、脑组织 MDA含量、血清 LDH活力等测定,来观察内源性 H2S在大鼠脑缺血再灌损伤中的作用。　　8.CSE基因敲除小鼠在制备脑缺血再灌注模型,通过神经功能评分、脑水肿、脑梗死体积等测定,观察内源性 H2S在小鼠脑缺血再灌损伤中的作用。　　实验结果:　　1、采用离体血管舒缩功能测定法显示,在1×10-7 mol/L U46619预收缩大鼠大脑中动脉和基底动脉上,ACh(10-5.5~10-8 mol/L)可以诱导产生浓度依赖性的血管舒张作用,其最大舒张率在大脑中动脉中可达73.9±4.2％;基底动脉中为74.6±5.8%。当祛除血管内皮细胞后,ACh介导的这种血管舒张反应消失。微电极记录细胞膜电位实验结果显示 ACh可以引起血管平滑肌细胞超极化的现象,其最大超极化幅度在大鼠大脑中动脉中可达-15.2±1.8 mV;基底动脉中为-17.4±2.1 mV。用30μmol/L L-NAME和10μmol/L Indo抑制 NO和PGI2的血管舒张作用后,ACh仍然可以诱导明显的血管舒张作用,在大鼠大脑中动脉和基底动脉中最大舒张率分别为45.4±3.9%和43.3±4.3%;同时 ACh也可以诱导的血管血管平滑肌超极化,其超极化幅度分别高达-9.7±2.4 mV和-13.7±1.3 mV。进一步应用100 nmol/L ChTx和1μmol/L Apa抑制 SKCa和IKCa时,这种非 NO、非 PGI2的血管舒张和超极化作用均消失。　　2、在 CSE siRNA在体转染大鼠脑血管中,CSE蛋白表达显著降低,同时血浆中H2S含量显著下降,但单用转染试剂或阴性 siRNA对 CSE表达及 H2S含量无影响。　　3、与正常大鼠相比,CSE siRNA转染大鼠大脑中动脉和基底动脉中,ACh介导的内皮依赖性的血管舒张作用显著降低,其最大舒张率分别降低至51.6±6.2%和52.4±4.3%,同时,ACh诱导的超极化幅度分别降至-6.83±0.6 mV和-9.7±1.2mV;当抑制了 NO和PGI2时,ACh介导的非 NO、非PGI2的血管舒张最大舒张反应分别降至21.3±3.8%(中动脉)、20.2±3.5%(基底动脉);同时血管平滑肌的超极化幅度分别降至-3.8±1.0 mV(中动脉)、-2.9±0.8 mV(基底动脉)。并且这种超极化和舒张程度的降低与 NO和PGI2的作用无关,而且转染试剂及阴性 siRNA对 ACh诱导的非 NO、非PGI2血管舒张反应和超极化均未有显著影响。　　4、在 CSE siRNA大鼠大脑中动脉中,抑制 NO和PGI2的舒血管作用的同时使用 IKCa和SKCa通道阻断剂,ACh介导残存的内皮依赖性的血管舒张反应和超极化反应随之消失。　　5、在 CSE siRNA大鼠大脑中动脉中,抑制了 NO和PGI2的同时,采用 PPG抑制 CSE后,由 ACh介导的残存的EDHF反应消除。　　6、在10-5~10-7 mol/kg范围内,NaHS对大鼠脑缺血再灌损伤具有保护作用,并且对脑缺血性损伤大鼠的大脑中动脉的血管收缩功能和内皮依赖性舒张功能有保护作用。　　7、CSE siRNA大鼠脑缺血再灌注后,神经功能评分、脑水肿、脑梗死体积、脑组织 MDA含量及血清 LDH活力均显著高于未转染大鼠,同时血管收缩功能和内皮依赖性舒张功能均有显著降低,给予10-6 mol/kg NaHS可逆转这种损伤效应。　　8、CSE基因敲除小鼠脑缺血再灌注后,神经功能评分、脑水肿、脑梗死体积均显著高于同窝野生小鼠模型组,给予10-6 mol/kg NaHS可改善这种损伤作用。　　结论:　　1.大鼠在体转染 CSE siRNA可有效地降低大鼠脑血管内 CSE的表达和H2S生成;　　2.大鼠脑血管中EDHF反应与内源性H2S密切相关,内皮源性的H2S是大鼠脑血管中的EDHF;　　3.内源性 EDHF/H2S对缺血性脑损伤大鼠大脑中动脉的血管收缩功能和内皮依赖性的舒张功能均有保护作用;　　4.内源性H2S在小鼠和大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用,内源性H2S的缺乏可加重脑缺血再灌注损伤;　　5.外源性小剂量的H2S对脑缺血再灌注损伤有保护作用。