论文部分内容阅读
微生物污染被认为是影响食品安全的主要原因之一。大肠杆菌广泛存在于环境中,食品在生产、包装及运输过程中,容易感染此菌,该菌属是国际上公认的食品卫生监测指示菌。有些致病菌株（如大肠杆菌O157:H7）能够对人体健康造成危害,甚至导致死亡。研究如何有效控制大肠杆菌对食品的污染以及建立快速灵敏的致病性大肠杆菌检测方法,对保障食品安全有着重要的意义。本文基于β-内酰胺酶水解青霉素的反应,应用酶联免疫吸附技术和免疫层析技术,通过高灵敏地检测青霉素的浓度,从而间接地测定大肠杆菌O157:H7的浓度,实现了提高检测灵敏度和缩短检测时间的目的。为了有效地控制食品中大肠杆菌的污染,本文将壳聚糖和聚乙烯醇混合后制备成膜,以混合膜作为基材,通过将传统的有机抗菌材料固定化于膜上,大大地提高了混合膜的抗菌效率,制备的氯化抗菌膜可以快速地杀灭大肠杆菌,实现了对大肠杆菌的有效控制。第1章,综述了大肠杆菌的概况、检测方法以及对大肠杆菌的防控手段。在第2章中,本研究通过青霉素的水解反应,将双抗夹心酶联免疫吸附技术（ds-ELISA）和间接竞争酶联免疫吸附技术（ic-ELISA）结合,建立了级联信号放大的检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫吸附方法。在ds-ELISA系统中,酶标板上包被了抗大肠杆菌O157:H7的多克隆抗体,大肠杆菌O157:H7通过免疫学反应被固定在酶标板上,结合抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体-生物素复合物,加入链霉亲和素,最后加入生物素化的β-内酰胺酶,如果样品中存在一定量的大肠杆菌O157:H7,酶标板上会存在对应量的β-内酰胺酶。向ds-ELISA体系中加入青霉素溶液,β-内酰胺酶则大量水解青霉素,将水解后的溶液转移到ic-ELISA体系中,通过高灵敏地监测青霉素含量的变化,从而间接地测定大肠杆菌O157:H7的浓度。本研究优化了链霉亲和素的添加浓度、生物素化β-内酰胺酶的添加量和β-内酰胺酶水解青霉素时的p H值,并且对青霉素水解动力学过程进行了分析。结果显示大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度为20 CFU/m L,经过级联信号放大的ELISA检测方法的灵敏度比传统ELISA方法高出1000倍。此外,使用本方法检测牛奶中的大肠杆菌O157:H7（2 CFU/g）,增菌6 h即可检测到阳性信号。综上所述,基于青霉素水解级联信号放大的ELISA实现了提高大肠杆菌O157:H7检测灵敏度和缩短该菌检测时间的目的。在第3章中,研究利用青霉素的水解反应,将免疫磁富集技术与免疫层析方法相结合,达到灵敏快速地检测大肠杆菌O157:H7的目的。首先,使用免疫磁珠富集样本中大肠杆菌O157:H7,磁珠-抗大肠杆菌O157:H7多克隆抗体-大肠杆菌O157:H7复合物（复合物A）进一步结合抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体-胶体金纳米粒子-β-内酰胺酶复合物（复合物B）,然后加入青霉素溶液,经过β-内酰胺酶的高效水解作用后进行磁分离得到上清溶液,在整个检测系统中,增加大肠杆菌O157:H7的数量可以导致β-内酰胺酶浓度增加,同时导致青霉素含量降低。最后采用商品化的青霉素免疫层析试纸条检测上清液中的青霉素含量变化,从而快速检测样本中大肠杆菌O157:H7的浓度。本研究优化了复合物B上抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体抗体的标记量和复合物B的添加量,得到的大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度为2×102 CFU/m L,比传统的免疫层析法的灵敏度提高了570倍。在第4章中,本研究将壳聚糖（CH）与聚乙烯醇（PVA）以不同的质量比混合成膜,经漂白剂处理后,混合膜中壳聚糖的氨基基团转化为卤胺基团,极大地增强了混合膜的抗菌效率,得到了具有高效抗菌率和机械性能良好的抗菌膜。用扫描电镜（SEM）对与抗菌膜接触后的大肠杆菌进行了表征,结果显示抗菌膜与大肠杆菌接触后,对大肠杆菌产生了不可逆转的杀灭作用。研究了壳聚糖/聚乙烯醇的质量比对氯化抗菌膜抗菌效率、机械性能、热稳定性和水蒸气透过系数的影响。当壳聚糖与聚乙烯醇的质量比为4:6时,氯化抗菌膜的断裂伸长率为24.646%,与纯壳聚糖膜的断裂伸长率相比得到了较大的提高,并且在30 min内可以杀灭108 CFU的大肠杆菌。热重分析结果显示氯化抗菌膜（Cl OCH4PVA6）有较好的热稳定性;Cl OCH4PVA6膜的水蒸气透过系数为4.173×10-11 g·m-2·s-1·Pa-1,表示氯化抗菌膜阻湿性能良好。氯化的抗菌膜可以有效地消除大肠杆菌,本研究为保障食品安全提供了技术支撑。在第5章中,选取甘油、木糖醇、山梨醇、吐温80、司盘80和PEG-6000作为增塑剂,分别加入混合膜中,研究不同增塑剂对氯化抗菌膜抗菌性能和物理性能的影响。研究结果表明增塑剂的添加不会对氯化抗菌膜的抗菌性能产生影响;加入甘油后,氯化抗菌膜（Cl OCH4PVA6G0.5）的断裂伸长率为36.442%,与Cl OCH4PVA6膜的断裂伸长率相比得到了提高。研究评价了不同甘油添加量对氯化抗菌膜抗菌性能和物理性能的影响。不同甘油添加量不会对氯化抗菌膜的抗菌性能造成影响,当甘油添加量为0.5 m L（Cl OCH4PVA6G0.5）时,混合膜的断裂伸长率为最大,Cl OCH4PVA6G0.5膜的水蒸气透过系数为1.3×10-11 g·m-2·s-1·Pa-1,添加0.5 m L的甘油降低了氯化抗菌膜的水蒸气透过系数,研究结果显示Cl OCH4PVA6G0.5阻湿性能较好,适用于作为食品包装的材料。大肠杆菌的污染是危害食品安全的重要原因之一,在本研究中,建立的检测方法可以快速灵敏地检测致病性大肠杆菌,制备的氯化抗菌膜可以有效地消除大肠杆菌。本课题对保障食品安全有着重要的意义。