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目的:本论文利用分子克隆的方法构建人源PD-1(hPD-1)的两种片段pET-22b-hPD-134-150和pET-22b-hPD-132-160的重组质粒,测序正确后,转化至原核表达系统BL21宿主菌,经IPTG诱导表达重组蛋白。hPD-1重组蛋白复性后,将高纯度的重组蛋白作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠,制备hPD-1蛋白的单克隆抗体,为制备具有病理诊断价值的单克隆抗体奠定一定的基础。方法:利用PCR扩增hPD-1胞外段基因,构建hPD-1重组质粒。将其转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达hPD-1蛋白后,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证,利用Ni-NTA柱亲和层析纯化包涵体表达的hPD-1蛋白,复性后由AKTA纯化系统进行分子筛凝胶过滤纯化。将纯化后的hPD-1蛋白作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠。免疫小鼠三次及一次加强免疫后取血,利用ELISA法测定血清的滴度,将血清滴度达到106的小鼠血清进行免疫组化(IHC)评价,最后利用杂交瘤技术制备anti-hPD-1单克隆抗体,利用ELISA法和IHC法筛选出效价高、IHC染色强、无非特异性染色的杂交瘤细胞株。最后对本论文制备的抗体进行亚型鉴定和纯化,利用SDS-PAGE检测纯化效果以及通过IHC和Western-blot评价anti-hPD-1单克隆抗体的性能。结果:1、成功构建pET-22b-hPD-134-150和pET-22b-hPD-132-160重组质粒,以终浓度0.5 mM IPTG于37℃诱导菌株6 h获得大量表达的hPD-1蛋白;2、利用所制备的hPD-1蛋白作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠,小鼠血清效价均达到106以上;IHC实验结果表明:膜定位较为清晰,阳性区域均出现较强染色;3、成功制备分泌anti-hPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞,最终筛选出四株杂交瘤细胞11F5-C9、9C12-A3、9C12-C8、9C12-C9;其中9C12-C8细胞株产生的抗体亚型是重链为IgG2a,轻链为κ型。四株细胞产生的抗体应用于IHC上均具有清晰的膜定位,阳性区域强着色,背景干净且非特异性染色少,同时也可应用于Western-blot检测;结论:在大肠杆菌表达系统中表达hPD-132-160蛋白作为免疫原,成功制备特异性强、亲和力高的anti-hPD-1单克隆抗体,在IHC实验上可获得清晰的膜染色,达到商业化要求。