神经胶质瘤在颅内肿瘤中发病率最高，呈浸润性生长，化疗是治疗脑胶质瘤的重要环节之一。目前认为化疗药物直接进入肿瘤内化疗可能成为最有效的途径。常规的化疗对脑胶质瘤的治疗作用有限，原因主要是血脑屏障使肿瘤中药物有效浓度低，而毒副作用却又使化疗难以维持，因而应用简单的方法使血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)最大开放并延长开放时间，使用低剂量的抗肿瘤药物使其最大化释放是治疗的一项新策略。血脑屏障可以动态调节物质在血液循环和脑组织的交换，保持脑组织的动态稳定，同时也限制了药物进入中枢神经系统。即使肿瘤组织破坏了血脑屏障，但是血肿瘤屏障(blood tumor barrier，BTB)的存在仍然限制抗肿瘤药物进入脑组织。国内外研究较多的并且尝试临床应用的是通过脑毛细血管内皮细胞上的内源性受体介导的药物转运方法。例如已经初步应用到临床的内源性受体包括胰岛素受体和转铁蛋白受体。随着研究的深入，人们发现这两类受体介导的药物转运存在很多问题，例如它们能够与内源性物质相互作用，从而妨碍脑组织摄取自身所必需的胰岛素或铁，导致中枢神经系统代谢紊乱。因此，在中枢神经系统的药物转运领域中亟需寻找新的转运药物的方法。　　 为了能够达到临床应用的目的，必须找到持续时间长、高选择性开放血脑屏障的方法，结合脑胶质瘤术后存在减压骨窗的特点，我们研究小组前期尝试了采用低频超声(Low frequency ultrasound，LFU)辐照选择性开放血脑屏障的方法，证明了应用1 MHz的低频超声，功率为12 mW条件下作用20 s是开放BTB的最适宜参数条件，同时，未见明显的神经组织的副损伤。罂粟碱是一种鸦片类的生物碱，在临床和实验中常通过静脉注射，鞘内注射或颅内注射来治疗血管痉挛。有报道鞘内注射罂粟碱治疗血管痉挛性疾病的过程中会引起血脑屏障的开放。药物通过血脑屏障一般有两种途径：细胞旁途径(开放紧密连接)和跨细胞途径(增加胞吞转运过程)。关于采用低频超声辐照和应用一定剂量的罂粟碱选择性开放血肿瘤屏障的机制尚不清楚。结合研究小组的前期研究结果和罂粟碱能够引起血脑屏障的开放的报道，本研究在建立大鼠脑胶质瘤模型上，尝试联合应用低频超声和罂粟碱，首先观察二者联合应用时，是否存在开放血肿瘤屏障的作用；在此基础上，进一步研究联合应用低频超声和罂粟碱开放血肿瘤屏障的分子机制，即是否通过开放紧密连接和/或增加胞吞转运过程的方式起作用，为神经胶质瘤等中枢神经系统疾病的治疗提供新途径。　　 材料与方法：　　 1、超声窗的制作：Wistar健康雌性大鼠，由中国医科大学实验动物中心提供，体重180～200g。术前10％水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉，头顶部皮肤用剪刀剪去，固定于立体定位仪上，正中矢状切开约2cm切口，钝性剥离骨膜，用牙科钻以大鼠冠状缝上中线右旁开3mm为中心各移去一块颅骨(3×3mm)，将表皮覆盖在骨窗并缝合上，5天后备用。　　 2、低频超声辐照：德力凯公司EMS-900型脑超仪器(中国医科大学附属第一医院脑功能检查室)，造影剂Optison在每一个辐照前10s经右股静脉注入，注射容量为0.05ml/kg，探头频率1MHz，探头直径2cm，照射深度设定为5mm，功率在一定范围内可调。　　 3、大鼠C6胶质瘤细胞的培养：含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，37℃，湿度100％，5％CO2条件下培养。　　 4、大鼠C6脑胶质瘤模型的制备：常规培养C6大鼠胶质瘤细胞，用不含胎牛的高糖DMEM培养基制备细胞悬液，浓度为1×106/10μl。腹腔注射10％的水合氯醛(3.5ml/kg体重)麻醉大鼠，在立体定位仪上用微量注射器注入大鼠右侧脑尾状核10μl C6胶质瘤细胞悬液，靶点为前囟前1 mm，矢状缝右侧旁开3 mm，深4.5 mm。肿瘤细胞移植7-14天后备用。　　 5、应用伊文思兰(evans blue，EB)检测大鼠血脑屏障通透性的变化。　　 6、应用透射电镜检测大鼠血脑屏障超微结构的变化。　　 7、应用RT-PCR法和Western blot法检测紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5以及质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的mRNA和蛋白表达水平的变化。　　 8、应用免疫组织化学法检测紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5以及质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的分布和表达水平变化。　　 9、统计学分析数据以均数士标准差(X±S)表示，两组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析和Bonferroni检验，P<0.05为差异有统计学意义。　　 结果：　　 1、成功建立了大鼠C6脑胶质瘤模型。　　 2、单独应用低频超声和罂粟碱分别增加了血肿瘤屏障通透性(p<0.05)；联合应用低频超声和罂粟碱进一步显著增加了通透性(p<0.01)。　　 3、透射电镜结果显示，单独应用低频超声和罂粟碱以及联合应用低频超声和罂粟碱分别开放了血肿瘤屏障的紧密连接。　　 4、联合应用低频超声和罂粟碱使血肿瘤屏障通透性逐渐增加，在应用1.5h处达到峰值，然后逐渐降低，12h恢复正常水平。　　 5、RT-PCR结果显示，单独应用低频超声和罂粟碱以及联合应用低频超声和罂粟碱均降低了紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5 mRNA的表达；增加了质膜微囊结构蛋白caveolin-1 mRNA的表达，质膜微囊结构蛋白caveolin-2mRNA的表达未见变化。　　 6、Western blot结果显示，单独应用低频超声和罂粟碱以及联合应用低频超声和罂粟碱均降低了紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表达水平；增加了质膜微囊结构蛋白caveolin-1的蛋白表达水平表达，质膜微囊结构蛋白caveolin-2的蛋白表达水平未见变化。　　 7、免疫组化结果显示，联合应用低频超声和罂粟碱降低了肿瘤微血管上的紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达；增加了质膜微囊结构蛋白caveolin-1的表达，质膜微囊结构蛋白caveolin-2的表达未见变化。　　 讨论：我们的研究小组通过前期的研究发现，1MHz、12mW、照射时间20s的条件可能是可逆性地开放血脑屏障的适宜条件，应用此适宜条件进行超声辐照不同时间，伊文氏兰做示踪剂观察血肿瘤屏障的通透性以确定最佳作用时间，发现超声辐照1.5 h时血肿瘤屏障通透性增加的最为显著。颈内动脉注射罂粟碱可以通过抑制血管平滑肌收缩而缓解血管痉挛，同时可能会导致血脑屏障通透性的破坏，我们研究小组通过一系列研究确定了0.5 ng/kg体重的罂粟碱能够有效选择性开放血肿瘤屏障，而对正常脑组织没有影响，是罂粟碱的最适作用浓度；进一步发现0.5 ng/kg体重的罂粟碱作用1 h时血肿瘤屏障通通性变化最明显，确定了罂粟碱的最佳作用剂量和作用时间。本研究利用上述研究中的低频超声辐照参数和罂粟碱的剂量，发现低频超声辐照后颈内动脉给予罂粟碱显著增加了血肿瘤屏障的通透性，与二者单独应用相比效果更显著，证明了联合应用低频超声和罂粟碱在增加血肿瘤屏障通透性上存在协同作用。为了确定低频超声和罂粟碱伍用的最佳作用时间，我们应用伊文氏兰做示踪剂进行观察发现，在作用1.5 h时伊文氏兰的通透性达到峰值，在12 h时恢复到作用前水平。　　 关于低频超声和罂粟碱选择性开放血肿瘤屏障的机制尚不清楚。有研究从微血管超微结构方面充分证实大分子通过由超声波介导的BBB开放的几个途径：①胞吞转运增加；②内皮细胞胞质开放-开窗和通道形成；③部分紧密连接打开；④内皮损伤处的自由转运(需要较高能量的超声波照射)。罂粟碱可通过抑制磷酸二酯酶活性使细胞内cAMP和cGMP增加，二者是细胞内重要的第二信使，参与多条信号通路的调节，可通过开放紧密连接的细胞旁途径和/增加胞吞转运的跨细胞途径增加血肿瘤屏障的通透性。本研究应用透射电镜观察了单独应用低频超声和罂粟碱，以及二者联合应用时对紧密连接状态的影响，发现低频超声和罂粟碱均可引起紧密连接的开放。　　 紧密连接位于脑微血管内皮细胞间，主要由跨膜蛋白(包括occludin和claudins家族)、胞质附着蛋白ZOs家族及连接黏附分子等成分构成，他们的结构变化对紧密连接功能的调节至关重要[2，3]。ZO-1是第一个发现的紧密连接蛋白，是MAPKG蛋白家族成员，紧密连接的紧密度与ZO-1和其他分子的磷酸化有关。Occludin是目前研究的比较清楚的紧密连接完整膜蛋白，Occludin与紧密连接的屏障和栅栏功能密切相关，大量的研究表明Occludin表达的调节可能是不同组织内皮细胞紧密连接通透性的一个关键因素。Claudin-5是脑微血管内皮细胞TJ中的特异性蛋白，是紧密连接形成的充要条件，BBB通透性的增加与Claudin-5表达减少密切相关。虽然这些紧密连接相关蛋白在维持紧密连接的结构和功能中起重要作用，但它们在不同种属、不同组织、不同条件下起不同作用，因此，同时综合分析几种主要蛋白的作用，可能有效地说明调节因子对紧密连接的影响。本研究检测了联合应用低频超声和罂粟碱后紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和claudin-5的表达和分布变化，结果与电镜和伊文氏兰等通透性试验相一致，低频超声和罂粟碱均减少了紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和claudin-5的mRNA和蛋白的表达水平，二者联合应用可以使上述蛋白的表达水平进一步降低；同时研究发现联合应用低频超声和罂粟碱能够改变紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和claudin-5的分布，这进一步从分子生物学水平上说明了低频超声与罂粟碱联合应用可以开放紧密连接。本研究首次从形态学和分子生物学水平上证明了联合应用低频超声和罂粟碱可以开放紧密连接，通过细胞旁途径开放血肿瘤屏障。　　 经典的跨细胞途径分为笼蛋白包被途径、质膜微囊诱导的内化途径和笼蛋白/质膜微囊非依赖途径。质膜微囊结构蛋白caveolins可分为三型，分别是caveolin-1，2和3。在脑内，caveolin-1，2主要表达在内皮细胞，而caveolin-3主要表达在星形胶质细胞。Caveolin-1是质膜微囊caveoliae的标志性蛋白，在维持caveolae形态、结构和功能中起重要作用，尤其在内皮细胞的内吞过程中起关键作用。由于caveolin-1是支架蛋白，因此被认为是caveolae中信号分子的主要调节子。有文献报道，caveolin-1表达水平的变化与BBB通透性的增加相关，而caveolin-2则协同caveolin-1完成胞吞饮转运功能。本研究检测了质膜微囊蛋白caveolin-1和caveolin-2的表达和分布变化，证明单独应用低频超声和罂粟碱以及联合应用低频超声和罂粟碱增加了质膜微囊结构蛋白caveolin-1的mRNA和蛋白的表达水平，而质膜微囊结构蛋白caveolin-2的mRNA和蛋白的表达水平未见变化，提示单独应用低频超声和罂粟碱以及联合应用低频超声和罂粟碱能够通过质膜微囊结构蛋白caveolin-1介导的跨细胞途径选择性开放血肿瘤屏障。　　 本研究首次研究了联合应用低频超声和罂粟碱对血肿瘤屏障通透性的影响，在分子水平上揭示了联合应用低频超声和罂粟碱能够通过细胞旁和跨细胞两条途径选择性增加血肿瘤屏障的通透性。因此临床上可以考虑将低频超声与罂粟碱联合应用以进一步有效的增加进入肿瘤组织的药物浓度，本研究为脑胶质瘤的治疗提供了新途径。　　 结论：　　 1、单独应用低频超声和罂粟碱分别增加了血肿瘤屏障通透性；联合应用低频超声和罂粟碱在增加血肿瘤屏障通透性上存在协同作用。　　 2、单独应用低频超声和罂粟碱以及联合应用低频超声和罂粟碱选择性开放了血肿瘤屏障的紧密连接。　　 3、联合应用低频超声和罂粟碱使血肿瘤屏障通透性增加，在作用1.5h处作用最显著，12h恢复正常水平。　　 4、单独应用低频超声和罂粟碱以及联合应用低频超声和罂粟碱降低了紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA和蛋白的表达水平并改变了其分布，提示单独应用低频超声和罂粟碱以及联合应用低频超声和罂粟碱能够通过细胞旁途径选择性开放血肿瘤屏障。　　 5、单独应用低频超声和罂粟碱以及联合应用低频超声和罂粟碱增加了质膜微囊结构蛋白caveolin-1的mRNA和蛋白的表达水平，提示单独应用低频超声和罂粟碱以及联合应用低频超声和罂粟碱能够通过质膜微囊结构蛋白caveolin-1介导的跨细胞途径选择性开放血肿瘤屏障。