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目的:采用大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO)模型,并给予锌离子螯合剂TPEN干预,观察大鼠脑梗死体积的变化及行为学的改变,检测大鼠缺血半暗带区域锌离子水平、细胞凋亡以及低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、多聚ADP核糖体聚合酶-1(PARP-1)、多聚ADP核糖聚合体(PAR)的表达,研究锌离子在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用,探讨锌离子参与脑缺血再灌注损伤的可能机制。
方法:180只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、MCAO组、MCAO+5mg/kgTPEN组和MCAO+15mg/kgTPEN组。大鼠于梗塞前30min腹腔注射TPEN,假手术组和MCAO组注射相同体积的含10%DMSO的生理盐水。使用线栓法制作MCAO模型,模拟缺血90min,分别再灌注0h、3h、12h、24h和72h。术中监测大鼠肛温、平均动脉压及心率,使其保证在正常范围。大鼠行Longa和FootFault神经功能评分及旷场分析实验,处死后迅速取脑,行TTC染色检测脑梗死体积,用锌离子荧光染料NewportGreen4(NG)和TSQ检测大鼠脑切片内缺血半暗带区锌离子水平,用TUNEL染色检测细胞凋亡并与TSQ双标记研究锌离子阳性染色与细胞凋亡的相关性。免疫组化方法检测HIF-1α和PAR表达,免疫印记方法检测PARP-1表达。
结果:1)MCAO组大鼠脑梗死体积随再灌注时间延长逐渐增加,相同再灌注时间点MCAO+5mg/kgTPEN组大鼠脑梗死体积与MCAO组相比无统计学差异,而MCAO+15m/kgTPEN组大鼠脑梗死体积比MCAO组明显减小(P<0.01)。2)MCAO组大鼠Longa评分随再灌注时间延长呈上升趋势,至72h时略有下降。给予5mg/kgTPEN后大鼠Longa评分改善不明显,而给予15mg/kgTPEN后大鼠Longa评分比MCAO组降低(P<0.05),再灌注24h后降低更加明显(P<0.01)。MCAO组大鼠FootFault评分与Longa评分呈棚似变化趋势,给予15mg/kgTPEN后大鼠FootFault评分比MCAO组明显降低(P<0.01)。3)旷场分析显示,MCAO组大鼠活动时间和站立次数比假手术组明显减少,而给予15mg/kgTPEN后大鼠活动时间和站立次数比MCAO组明显增多(P<0.01)。4)NG和TSQ染色均显示MCAO组大鼠缺血半暗带区有大量锌离子染色阳性细胞,并随再灌注时间延长呈递增趋势,给予15mg/kgTPEN后锌离子染色阳性细胞数目比MCAO组显著减少(P<0.01)。5)TUNEL染色结果显示,MCAO组大鼠缺血半暗带区出现大量凋亡细胞,给予15mg/kgTPEN后大鼠凋亡细胞数目比MCAO组显著减少(P<0.01)。将TSQ和TUNEL染色双标记,可观察到二者在MCAO再灌注大鼠缺血半暗带区共表达。6)MCAO组大鼠缺血半暗带区HIF-1α及PAR表达比假手术组显著增多,并随再灌注时间延长呈递螬趋势,给予15mg/kgTPEN后大鼠HIF-1α及PAR表达比MCAO组明显减少(P<0.01)。7)MCAO组大鼠PARP-1表达比假手术组明显增多,并随再灌注时间延长呈递增趋势,给予15mg/kgTPEN后大鼠PARP-1表达比MCAO组明显减少(P<0.01)。
结论:1)在局灶性脑缺血大鼠中,锌离子参与了脑缺血再灌注损伤,过高的锌离子水平与凋亡有相关性。2)细胞内锌离子水平的下降可以减少局灶性脑缺血大鼠的脑梗死体积,并改善神经功能评分。3)锌离子参与脑缺血再灌注损伤的机制可能与HIF-1α表达及PARP-1活化有关。