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蛋白质相互作用的研究是阐述基因功能的重要手段。随着蛋白质组学的迅速发展,在不同生物体中进行的大规模的蛋白质相互作用研究逐步成为生物学领域的一个重要方面。热休克蛋白(heat schok proteins, HSPs)是细胞内高度保守的,表达丰富的一类蛋白质。HSPs作为分子伴侣参与细胞的各种代谢活动,主要包括：促进新生多肽的合成折叠；防止在正确的多聚体形成前,蛋白亚单位不恰当的折叠和聚集；协助其它蛋白分子在细胞内跨膜转运；促进受损或变性蛋白质的恢复或加速其降解。当细胞受到各种应激如高温、氧化刺激时,产生的HSPs可以增强细胞对损伤的耐受能力,从而维持细胞的正常代谢功能,提高细胞的生存率。DNAJC12蛋白是HSP40蛋白家族成员之一,作为一种共伴侣分子参与蛋白的折叠、转运及翻译起始等。研究发现,DNAJC12蛋白在多种肿瘤细胞中均表达上调,癌组织中DNAJC12表达增加已得到证实,并与其发生发展具有密切联系,但其在癌症发生发展过程中发挥何种作用目前尚不清楚。通常,蛋白质通过与其它蛋白质间的相互作用发挥其生物学功能。因此,通过研究DNAJC12蛋白在信号转导过程中形成的蛋白质复合体的动态变化,有助于全面揭示DNAJC12蛋白在癌症的发生发展中发挥调控功能的分子机制。随着蛋白质组学的迅速发展,大多数细胞的生物学功能都是由蛋白复合体而非单一蛋白来完成的,所以识别和分析蛋白复合体的组分是研究蛋白功能所必需的。串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)技术是近年发展起来的用于研究蛋白质复合体的新方法。它是在目的蛋白一端导入两个特异性的蛋白标签,经过两步亲和纯化,获得在生理条件下与目的蛋白相互作用的蛋白质,随后用质谱进行鉴定。TAP技术较其它纯化技术最大的优势在于它集合了亲和纯化和免疫共沉淀两种技术的优点,可以获得接近生理条件高纯度、高浓度的蛋白质复合体,降低了假阳性率。在本研究中我们选择了链霉亲和素结合肽(strptavidin binding protein, SBP)和钙调素结合肽(calmodulin binding protein, CBP)作为标签的TAP系统。SBP标签是一种新的链球菌抗生物素蛋白结合肽,由45个氨基酸残基组成,SBP标记的蛋白质可用固定化的链球菌抗生物素蛋白进行纯化,使用生物素进行洗脱,洗脱条件非常温和,无需使用烟草花叶病毒(tobacco etch virus, TEV)蛋白酶进行酶切,避免TEV蛋白酶酶切过程中对靶蛋白的影响,减少了大分子物质对蛋白复合体的污染。同时,SBP标签比ProtA标签更小,可有效降低TAP标签对诱饵蛋白折叠形成正确的二级结构的影响,避免因TAP标签的融合表达影响靶蛋白质复合体的形成。本研究中,为避免因瞬时转染引起融合蛋白的过高表达及其导致的非天然或非特异的蛋白相互作用而造成假阳性鉴定结果,我们通过G418筛选建立起稳定表达融合蛋白的细胞系MCF-7-pCTAP-DNAJC12-V1和MCF-7-pCTAP-DNAJC12-V2.为排除TAP标签非特异结合而引起的假阳性,我们还建立起稳定转染空载体的MCF-7-pCTAP细胞系作为TAP的阴性对照系统。经过TAP分离纯化后的蛋白质复合体,经典的实验策略是经SDS-PAGE凝胶电泳进行分离。本研究将纯化得到的蛋白质用SDS-PAGE凝胶电泳分离后进行银染,分析差异蛋白条带切下进行质谱(mass spectrometry, MS)鉴定。分析阴性对照组和各靶蛋白之间的差异蛋白条带,发现14个差异条带与DNAJC12-V1蛋白特异结合,3个差异条带与DNAJC12-V2蛋白特异结合,选取其中染色清楚的条带进行质谱鉴定。质谱鉴定和数据库搜索过程也是决定实验结果可靠性的关键步骤,本研究在质谱鉴定过程中严格设定质谱仪的工作参数和搜库标准,获得DNAJC12-V1复合体的4个候选蛋白质数据信息,包括非肌肉型肌球蛋白重链(nonmuscle myosin heavy chain, MYH9)、肌球蛋白调节轻链12B(myosin regulatory light chain 12B,MRCL2)、假设蛋白(hypothetical protein)和肌球蛋白调节轻链(myosin regulatory light chain)。这些蛋白的发现为揭示DNAJC12蛋白在乳腺癌发生发展中发挥的功能提供了多个功能线索和筛选分子。总之,我们通过串联亲和纯化技术分离MCF-7-pCTAP-DNAJC 12-V 1细胞中的DNAJC12-V1蛋白复合体以及分离MCF-7-pCTAP-DNAJC 12-V2细胞中的DNAJC12-V2蛋白复合体,使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白复合体并进行差异蛋白条带的分析,挖取差异蛋白条带进行MALDI TOF/TOF质谱鉴定。本研究取得如下成果：1.成功构建pCTAP-DNAJC12-V1和pCTAP-DNAJC12-V2真核表达载体。2.通过G418筛选出MCF-7-pCTAP、MCF-7-pCTAP-DNAJC12-V1及MCF-7-pCTAP-DNAJC 12-V2稳定表达细胞系。3.经SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白复合体后分析差异蛋白条带,选取DNAJC12-V1特异性结合的7条差异蛋白条带及DNAJC12-V2特异结合的1条差异蛋白条带进行质谱鉴定,得到DNAJC12-V1复合体的4个候选蛋白质。4.这些差异蛋白的发现对于研究DNAJC12蛋白在乳腺癌发生发展中的功能具有重要的提示意义,另外DNAJC12-V1与DNAJC12-V2之间差异蛋白的发现为深入研究DNAJC12蛋白的功能奠定了基础。综上所述,本研究采用串联亲和纯化技术在接近生理状况下研究DNAJC12的相互作用蛋白质,发现了许多潜在的DNAJC12蛋白的相互作用分子,为进一步研究DNAJC12蛋白的生物学功能和分子机制打下了良好的基础。