研究背景近年来急性白血病(AL)治疗取得很大进展,但5年长期生存率仍只有30%～40%,约50%左右的患者在取得缓解(CR)后仍会出现复发,因此在治疗中评价复发的危险程度是个性化治疗的关键。目前认为微小残留病(MRD)与患者复发有高度相关性。MRD是白血病患者经过治疗,临床和血液细胞学达到完全缓解后,体内仍残留白血病细胞的状态。急性白血病患者初发时,患者体内的白血病细胞可达1012以上,经化疗后可降到109以下,若不进行监测和治疗,患者有可能由于检测灵敏度的原因复发。细胞形态学和染色体核型分析的方法难以准确的反映患者缓解后体内残留的白血病细胞水平,目前公认的实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)和多参数流式细胞术(FCM)是检测MRD最有效的两种方法。RQ-PCR技术是目前常用的灵敏度最高的MRD检测方法,达10-6,可对含有融合基因、突变基因和异常表达基因的白血病亚型进行精确检测,但是仅对具有特异性分子生物学异常的40%的急性淋巴细胞白血病(ALL)和30%的急性髓系白血病(AML)患者适用。对于大部分发病时无特异的分子生物学标记可供检测的患者,RQ-PCR检测MRD受到限制,此类患者异质性明显,预后差别大,急需找到适合的检测指标对其危险度进行分层。FCM通过对白血病相关免疫表型(LAIP)进行检测,灵敏度可达104-10-5,现已成为检测MRD最有前景的方法之一,具有十分重要的临床意义。MRD水平不仅有助于对患者进行危险度分层、调整治疗方案,而且是判断患者预后及预测复发趋势的一个有效因子。根据MRD水平,对高度复发风险的患者增加化疗强度,减少低复发风险的患者因过度化疗带来的毒副作用,避免形态学缓解后治疗的盲目性以及早期复发而形态学难以辨认所致的治疗延迟,最终提高治愈率。过去,4色流式细胞术是临床最常用的流式技术,但该技术不仅抗体组合的选取受限,而且标本及抗体消耗较大、操作复杂,使结果的准确性受影响。现在越来越多的临床实验室开展4色以上检测技术进行急性白血病MRD分析。目前由于国内外对于FCM检测MRD方法的规范化、抗体组合的选择、阳性阈值的确定及最佳检测时机方面尚未达成统一标准,各实验室检测结果及临床应用上存在较大差异。因此,明确本实验室仪器的检测条件、标准、寻找规律并逐渐与国外相关标准接轨意义重大。目的1.本研究旨在建立一套本实验室稳定的、可重复性、精确定量的三激光八色流式细胞仪检测MRD的方法,并对方法学进行灵敏度检验。2.分析初发急性髓系和淋巴细胞白血病患者的免疫表型,筛选出白血病相关免疫表型(LAIP),确定检测MRD的抗体组合。3.动态监测MRD的水平,分析MRD与复发的关系,确定本实验室MRD阳性和阴性的界值,探讨该方法用于检测急性白血病微小残留病变的临床应用价值。方法1.分析我院血液科自2011年1月起动态检测骨髓MRD水平的75例急性白血病患者。所有患者在首次接受MRD检测后,定期复查骨髓,平均间隔时间为2.5个月(1-6个月),平均随访次数4次(3-6次)。根据预后确定MRD阈值,分析MRD的动态水平与临床因素及临床转归的关系。2.对本实验室流式细胞仪进行荧光补偿调节,在每个通道分别单标抗体调节的基础上逐渐增加抗体组合数目至八色抗体组合,确定各通道荧光补偿值。3.先后采用细胞株(Kasumi、KG-la)、初发急性白血病患者骨髓标本与正常骨髓标本混合,分析检测方法的灵敏度。4.收集我院血液科2013年10月至2014年1月确诊并接受正规化疗的急性白血病患者骨髓标本25例。对所有患者在初诊时进行免疫表型分析,筛选患者LAIP。在缓解治疗后采取两组八色抗体组合规范化检测患者MRD水平,同时检查患者骨髓细胞形态学变化。分析诱导治疗后LAIP的变化情况、影响MRD水平的临床因素以及MRD的动态变化趋势,并比较不同MRD水平间骨髓形态学原始、幼稚细胞百分比的差异。5.统计方法：使用SPSS17.0软件,计量指标用均数±标准差表示,样本均数的比较采用t检验,样本间率的比较采用X2检验。MRD水平与复发率和生存率的关系采用Kaplan-Meier法生存曲线。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.病例资料分析结果1.1患者一般资料75例患者中,急性淋巴细胞白血病患者20例,非M3的急性髓系白血病55例。所有患者中男41例,女34例。患者中位年龄35岁(10-65岁),中位随访时间11个月(9-34个月),7例患者复发。1.2白血病相关免疫表型55例AML患者中,49例(89.1%)患者检出特异性的LAIP,其中33例(67.3%)患者具有2-3个异常免疫表型。检出LAIP的49例患者中,跨系表达和非同步表达多见,跨系表达的患者42例(85.7%),非同步表达40例(81.6%)。跨系表达中以CD45/CD34/CD33/CD13/CD56组合检测频率最高,占67.3%(33/49),其次为CD45/CD34/CD33/CD13/CD7占63.3%(31/49)。非同步表达中CD45/CD34/CD117/CD33/CD64为57.1%(28/49)。20例ALL患者中,B-ALL患者16例、T-ALL患者4例,所有患者均检测特异性的LAIP。B-ALL患者中,跨系表达中以CD45/CD19/CD22/CD10/CD13组合检测频率最高,为43.8%(7/16),表达量异常以CD38表达减弱或缺失最多见,占50%。4例T-ALL患者均存在CD7/TDT抗原异位表达。1.3临床因素与预后分析分析患者临床资料与复发问的关系,患者性别、年龄、初发时外周血白细胞、血小板、骨髓原始细胞百分比及LAIP数目与复发无显著关系。患者初发时外周血血红蛋白水平和诱导缓解次数与患者转归相关,P值分别为0.021和0.017。1.4MRD的动态变化与预后分析75例患者中7例患者CR后复发。分别将0.01%与0.05%作为MRD阴阳性阈值,分析MRD水平与转归的关系。结果显示,根据MRD变化水平将患者分为持续≥0.05%、持续<0.05%和阴阳性均存在三组时,0.05%作为阈值与复发有显著关系。20例持续MRD≥0.05%的患者与28例MRD持续<0.05%、27例至少有一次MRD≥0.05%的患者间无复发生存期均存在显著差异(P=0.005,P=0.038)。20例持续MRD≥0.05%的患者与55例至少一次MRD<0.05%患者间1年的复发率分别为22.9%和0%。2.荧光补偿调节FITC与PE、PE-Cy5与PE、APC-Cy7与PE-Cy7、APC-Cy7与(?)APC、FITC与AmCyan以及Pacific Blue与AmCyan通道间补偿值较高。3.灵敏度(1)Kasumi、KG-la两种细胞株分别与健康人外周血细胞混合,标记两组4色抗体组合进行灵敏度检测,理论为0.001%的细胞悬液,可检测到10-5细胞株。(2)KG-1a细胞与正常骨髓细胞混合,分别进行两组4色和8色抗体组合标记后检测,理论为0.001%的细胞悬液,4色和8色抗体标记检测的灵敏度均为10-5。(3)初发白血病患者与非白血病患者骨髓标本混合以10倍倍比稀释,标记两组8色抗体组合可检测到10-4的白血病细胞。4.规范化检测结果4.1病例特点及一般资料25例急性白血病患者,其中急性髓系白血病患者14例,急性B淋巴细胞白血病患者11例。25例患者中,男14例,女11例,年龄16-57岁,中位年龄33岁。所有患者在诱导缓解治疗后血象恢复过程中应用多参数流式细胞术检测MRD水平。4.2LAIP及变化情况25例患者在初发时其中23例检测出特异性LAIP。2例AML患者无可识别的LAIP组合,不表达CD34和CD117抗原。23例具有特异性LAIP的患者中,9例患者只有1个LAIP组合,14例患者具有2个或2个以上LAIP组合。在诱导缓解治疗后,20例患者仍可检出原有的LAIP,3例AML患者发生LAIP变化。其中,2例患者非同步抗原CD56表达消失,1例患者CD34阴性。4.3抗体组合的选取根据免疫表型和LAIP,14例髓系和11例B淋巴系白血病患者可分别采取相同的两组8色抗体组合进行标记检测。髓系CD34/CD64/CD13/CD56/CD117/CD45/CD11b/CD4CD34/CD7/CD33/HLA-DR/CD117/CD45/CD15/CD19淋系CD34/CD10/CD33/CD19/CD20/CD45/CD38/CD4CD58/CD13/CD33/CD19/CD34/CD45/CD123/CD44.4影响MRD水平的因素分析患者的临床资料与MRD水平间的关系,患者性别、年龄、初发时外周血白细胞、血红蛋白、血小板以及骨髓原始细胞百分比与MRD水平无明显关系。LAIP的类型与MRD水平有关,初发时存在跨系表达的患者缓解后MRD水平显著高于无跨系表达者(P=0.003)；初发时存在非同步表达的患者诱导缓解后MRD水平与不存在该类型LAIP的患者MRD水平有显著差异(P=0.006)。4.5MRD的动态变化连续监测5例AML患者诱导治疗CR后及第一次、第二次巩固治疗后的MRD水平发现,患者MRD水平呈下降趋势,MRD值集中于0.01%-0.05%。4.6骨髓细胞形态学与MRD结果25份骨髓标本经诱导治疗后均达到形态学完全缓解,FCM检测患者MRD后将患者分为MRD阳性组(MRD>0.01%)和MRD阴性组(MR《0.01)。16例MRD阳性患者骨髓涂片原始、幼稚细胞百分比的均数±标准差为2.50%±1.366%。MRD阴性组9例,均数±标准差为0.89%±0.782%。MRD阳性与阴性组间骨髓涂片原始、幼稚细胞占骨髓有核细胞百分比有显著差异(P=0.001),MRD阳性组患者骨髓涂片原始、幼稚细胞占骨髓有核细胞百分比高于MRD阴性组。结论通过病例分析掌握了急性白血病LAIP的表现形式。AML患者中,以CD56、CD7的跨系表达和CD64的非同步表达多见。B-ALL患者中,以CD38的减弱或缺失和CD13的跨系表达最多见,该表达形式与急性白血病的转归相符。动态监测患者MRD水平对判断预后有重要价值。当MRD的动态水平持续≥0.05%时,提示患者复发风险增高,应加强治疗方案、预防复发。本研究建立了本实验室三激光八色流式细胞术检测急性白血病微小残留病的检测条件,确定了流式细胞术检测MRD的灵敏度达10-5。通过对临床标本的规范化检测,统一了抗体组合,保证了检测结果的特异性。