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研究目的:(1)观察rh UTI对脓毒症小鼠脾脏DC表面共刺激分子表达、DC细胞凋亡及对脓毒症小鼠生存率的影响。(2)观察rh UTI对LPS刺激下小鼠脾脏DC免疫功能的影响。(3)探究ERS在rh UTI对DC免疫功能调节中作用。研究方法:(1)体内实验设药物干预组、模型组、假伤组,药物干预组与模型组均采用CLP法制备脓毒症小鼠模型后,药物干预组予rh UTI和乌司他丁注射液(10 000U/Kg,50 000U/Kg,250 000U/Kg),而模型组和假伤组予同体积生理盐水,分别于术后0.5、12及24h进行肌肉注射:分别于术后12、24、48、72、96、120、144及168h计数各小组存活小鼠数目,Kaplan-Merer法进行生存率分析;分别于术后24、48及72h留取各小组小鼠外周血血清检测TNF-α,IL-12,IL-4,INF-γ;分别于术后24、48及72h处死各小组小鼠并提取其脾脏DC,采用流式细胞术检测细胞表面共刺激分子CD80、CD86及MHC-II表达情况;分别于术后24、48及72h处死各小组小鼠并提取脾脏DC,采用流式细胞术检测其细胞凋亡情况。(2)体外实验分离提纯正常小鼠脾脏DC后,以5×10~5/ml密度种板,设实验组、对照组和正常组,稳定生长2h后,实验组分别给予乌司他丁注射液(0、300、900、2700及8100U/ml)及rh UTI(0、300、900、2700及8100U/ml)孵育2h,再加入LPS(100ng/ml)刺激,对照组只予同浓度LPS刺激,正常组不刺激,只给与同体积PBS:分别于24h、48h及72h后收集各组细胞上清,ELISA检测IL-12、TNF-α、IL-4及INF-γ;收集各组细胞,流式细胞术分析表面共刺激分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子表达;分别于12、24、48及72h后收集各组细胞,并采用流式细胞术分析细胞凋亡情况。(3)体外实验分离提纯正常小鼠脾脏DC后,以5×105/ml密度种板,生长2h后,设实验组、对照组,实验组予乌司他丁注射液(0、300、900、2700及8100U/ml)及rh UTI(0、300、900、2700及8100U/ml)孵育1h,再加入LPS(100ng/ml)刺激12h;对照组不予药物刺激,只予同浓度LPS刺激;同时分离提纯正常小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞后,并以1×10~6/ml密度种板,稳定生长2h后,加入刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)5μg/ml刺激激活12h,与DC共培养(200:1)72h后,收集上清液,应用ELISA检测IL-4和INF-γ。随后加入细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting Kit-8,CCK-8)试剂,孵育3h后,使用酶标仪检测450nm处吸光值(OD450nm),并记录分析。(4)体外实验分离提纯正常小鼠脾脏DCs后,以5×10~6/ml密度种板,稳定生长2h后,实验组分别给予乌司他丁注射液(2700U/ml)及rh UTI(2700U/ml)干预,1h后再加入LPS(100ng/ml)刺激,对照组只予以同样浓度的LPS刺激;24h、48h及72h,收集细胞,裂解进行蛋白分析。结果:(1)rh UTI可以明显提高脓毒症小鼠生存率,与乌司他丁注射液相比无显著差异。体内注射rh UTI可以提高脓毒症小鼠脾脏DC表面分子MHC-II、CD80、CD86表达,降低DC凋亡率,其中以250 000U/kg剂量及24h时间点为著;(2)rhUTI可以降低LPS刺激下小鼠脾脏DC细胞凋亡,且以2700U/ml浓度刺激48h时间点尤为明显;(3)中-高等剂量(2700U/ml~8100U/ml)的rh UTI可以促进LPS刺激下小鼠脾脏DC细胞表面分子MHC-II、CD80及CD86表达,且以刺激48h时间点最为明显;(4)中-高等剂量(2700U/ml~8100U/ml)的rhUTI可以降低LPS刺激下小鼠脾脏DC细胞凋亡,且以刺激48h时间点最为明显;(5)rh UTI药物干预组DC与T细胞共培养细胞上清液中Th1型相关细胞因子(INF-γ)较对照组明显增高,而Th2相关的细胞因子(IL-4)较对照组降低;提示T细胞增殖明显且以Th1为主;(6)rh UTI药物干预组小鼠外周血血清与DC成熟分化相关细胞因子IL-12、TNF-α较对照组升高;(7)rh UTI药物干预组LPS诱导小鼠脾脏DC表达与ERS相关蛋白GRP-78表达下降,同时与凋亡相关蛋白chop和caspase-12表达明显下降。结论:(1)高剂量(250 000U/kg)rh UTI能显著提高脓毒症小鼠生存率,分析与其增强小鼠脾脏DC免疫功能有关。(2)中-高等剂量(2700U/ml~8100U/ml)的rhUTI可以降低小鼠脾脏DC凋亡率,并增加其表面分子表达,进而增强细胞免疫功能。(3)中-高等剂量(2700U/ml~8100U/ml)的rh UTI对小鼠脾脏DC免疫功能改善与ERS相关。