【摘 要】
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芳烃化合物是一类具有一个或多个苯环的化学物质。目前,已有许多研究报道多个种属的细菌和真菌可以通过龙胆酸(2,5二羟基苯甲酸)途径代谢芳烃化合物进入三羧酸循环,同时也有
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芳烃化合物是一类具有一个或多个苯环的化学物质。目前,已有许多研究报道多个种属的细菌和真菌可以通过龙胆酸(2,5二羟基苯甲酸)途径代谢芳烃化合物进入三羧酸循环,同时也有少量报道古菌可通过龙胆酸途径降解芳烃物质。龙胆酸途径是芳烃代谢中重要的开环途径之一,包含两个分支途径——异构途径和水解途径。迄今为止,Pseudomonas putida NCIMB9869是唯一被报道的含有两条完整的龙胆酸代谢途径的菌株,但在分子水平上没有任何研究报道;Haloferax sp.strain D1227和Haloarcula sp.strain D1是目前报道的仅有的两株可以通过龙胆酸途径代谢芳烃的嗜盐古菌,但完整的代谢途径无分子水平的研究报道。本研究通过对细菌Pseudomonas putida XL501(Pseudomonas putida NCIMB9869的自然突变株)基因组信息进行生物学分析,发现了潜在的龙胆酸代谢异构途径的关键酶——顺丁烯二酸单酰丙酮酸异构酶的编码基因xlgL和两个龙胆酸代谢水解途径的关键酶——顺丁烯二酸单酰丙酮酸水解酶的编码基因xlgF1和xlgF2,将其克隆到表达载体pET-28a上,并在E.coli BL21(DE3)中进行表达和纯化,并对粗酶液和纯化蛋白分别进行相关酶学检测,均检测到了相应的活力。结果证明:顺丁烯二酸单酰丙酮酸在XlgL的催化下异构生成反丁烯二酸单酰丙酮酸,E.coli BL21(DE3)[pET-28a-xlgL]粗酶液比活力为0.0003 0.0003U/mg,纯化后XlgL比活力为0.0035 0.0011 U/mg;XlgF1和XlgF2均可以催化顺丁烯二酸单酰丙酮酸水解生成顺丁烯二酸和丙酮酸,E.coli BL21(DE3)[pET-28a-xlgF1]和BL21(DE3)[pET-28a-xlgF2]粗酶液的比活力分别为0.0028 0.0032U/mg和0.0018 0.0006U/mg,纯化后XlgF1和XlgF2的比活力分别为0.1700 0.0300 U/mg和0.1500 0.0458 U/mg,进一步确定了该菌株中确实存在两条龙胆酸代谢途径的相关代谢基因。嗜盐古菌Haloferax vocalnii WFD11是一株富盐菌属的古菌,常用作嗜盐古菌的表达宿主。迄今为止尚无报道该菌可以利用芳烃为唯一碳源和能源生长,早期研究报道菌株WFD11也没有龙胆酸1,2-双加氧酶的活力。本研究通过高效液相色谱检测H.volcanii WFD11生物转化3-羟基苯甲酸的产物,检测到了龙胆酸的累积;并通过生物信息学分析该菌株的基因组信息,寻找到一个潜在的龙胆酸1,2-双加氧酶编码基因hagA,并连接在表达载体pTA1228上,在H.volcanii H1424中进行表达和纯化,并对粗酶液和纯化蛋白HagA进行相关酶学检测,均检测到了龙胆酸1,2-双加氧酶的活力。H.volcanii H1424[pTA1228-hagA]粗酶液的比活力为0.0100 U/mg,纯化后HagA的比活力为0.0248 U/mg;并通过荧光定量PCR证明hagA是组成型表达。本研究丰富了细菌降解芳烃物质的龙胆酸途径代谢途径的多样性,也帮助我们认识古菌代谢芳烃物质的龙胆酸途径及古菌和细菌代谢芳烃的差异。
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