淡水资源是地球上绝大多数生物赖以生存的基础,然而淡水资源仅占地球总水资源的3%左右,国内乃至世界上仍有许多地区存在淡水资源紧缺的问题。因此合理节约淡水资源、开发以及利用咸水资源迫在眉睫。同时,随着生活水平的逐渐提高,人们对餐桌上水产的肉质和风味也提出了更高的要求。近年来,淡水鱼类的咸水养殖开始在一定区域得到推广和应用。用咸水水域养殖淡水鱼类不仅能降低鱼类病害的发生,还能有效地改善产品的肉质和风味,提高商品鱼的经济价值和养殖效益。因此,近年来国务院和农业农村部均出台相关政策,提倡大力发展咸水水域的水产养殖产业。然而,咸水水产养殖也面临着一些重要的挑战,如高盐度水体会影响水生动物的生长、发育和繁殖率。已有研究表明,高盐胁迫会导致鱼类的氧化应激,使鱼类的生长率下降,造成养殖生产减产。因此,系统探究鱼类的渗透压调控和适应机制,有助于咸水水域水产养殖业的健康发展。目前已有的研究主要是针对鱼类的离子转运能力和渗透效应物方面,但仍存在一定的局限性,例如:渗透压调节过程中物质代谢的变化,以及不同营养物质代谢在渗透压调节过程中的作用仍不清楚。本研究以罗非鱼为研究对象,在探究其渗透压调节过程中的物质代谢和蛋白质调控网络的基础上,进一步探讨了糖代谢在此过程中的作用。作为重要养殖种类,罗非鱼不仅能适应广泛的水体盐度变化,还有较完整的基因组信息,是研究鱼类渗透压调控机制的优良模式动物。本研究首先对罗非鱼来源的脑细胞系分别进行高渗（600m Osm/kg）和极高渗（800m Osm/kg）胁迫12h处理,随后通过分析两种不同高渗胁迫下细胞代谢组学和蛋白质组学的变化,对细胞渗透调节过程中代谢网络和蛋白质网络的变化进行了探索。取得的主要结果和结论如下:1.罗非鱼细胞适应不同渗透压胁迫的物质代谢变化在高渗和极高渗胁迫12 h条件下,成功定性和定量出大量的差异表达蛋白和代谢物,其中定性6607种蛋白,定量6589种蛋白,这些差异表达蛋白主要富集于细胞核中,其次是细胞质,以及细胞外区域。经代谢组学分析,共定量12837种代谢物,所注释的345种差异代谢物质中,有51%被成功鉴定,这些物质主要包含有机酸、核苷酸及其衍生物、脂质及其衍生物和有机氧化类物质。在600m Osm/kg条件下,12 h胁迫后细胞系的贴壁数量明显减少,且出现轻微皱缩。通过蛋白质组学鉴定,与对照组（310m Osm/kg、12 h）相比,共获得了145种差异表达蛋白,其中88种显著上调,57种显著下调,差异表达蛋白主要富集到ECM-受体相互作用、氮代谢、硫辛酸代谢和其他信号通路中。在蛋白质组学的分析结果中发现合成和转运兼容有机渗透物质的蛋白如MIPS、IMPA1、GS、SLC6A6等表达显著提升;其相应的产物如肌醇、谷氨酰胺等代谢物的组学鉴定含量也显著提升。这些结果表明PI3K-Akt和p53信号通路均可能参与高渗胁迫下细胞周期的停滞和细胞凋亡,并且此时累积兼容有机渗透物是细胞重要的高渗调节手段。在800m Osm/kg条件下,12 h胁迫后细胞系贴壁数量显著降低,绝大部分细胞出现漂浮和死亡的现象。与对照组相比共有625种差异表达蛋白,其中192种蛋白显著上调,433种显著下调,主要富集到PI3K-Akt、p53、核糖体、JAK-TAT、Fox O和HIF-1等信号通路。代谢组分析结果表明有16种差异表达代谢物被成功鉴定,其中4种显著上调,12种显著下调,这些代谢物中参与脂质代谢的代谢物均上调,而兼容有机渗透物质和氨基酸都显著下调。此外,蛋白质组分析结果还显示,极高渗胁迫下多个涉及固醇合成代谢的蛋白质丰度显著增强。这些结果提示,在极高渗胁迫条件下,HIF-1、Fox O、JAK-STAT和Hippo信号通路均参与对正常细胞周期和代谢的干扰,并诱导细胞凋亡。与高渗胁迫下不同的是,极高渗胁迫下细胞并没有通过累积有机渗透物质来进行渗透调节,而是更倾向于走向细胞周期停滞和凋亡。蛋白质组学和代谢组学联合分析的结果显示,在600m Osm/kg的高渗胁迫下,两组学共富集了4条KEGG通路,分别是嘧啶代谢、链霉素生物合成、磷酸肌醇代谢和磷脂酰肌醇信号系统。而在800m Osm/kg的极高渗胁迫下,两组学所共同涉及的KEGG通路有40条,分别为MAPK信号通路、Pas信号通路、HIF-1信号通路和Fox O信号通路等。此外,随高渗胁迫的增强,核糖体相关蛋白丰度逐渐下降。以上结果证明,嘧啶合成代谢的下调可能介导了高渗胁迫下细胞周期的停滞,而磷酸肌醇代谢和磷脂酰肌醇信号通路的增强,表明肌醇合成在细胞的高渗调节过程中发挥着重要作用;此外,HIF-1和Fox O等信号通路可能介导极高渗胁迫对细胞正常状态的破坏。高渗胁迫下核糖体相关蛋白的下调可能降低两种高渗胁迫下细胞中蛋白合成速度,并进而影响细胞周期。2.糖和肌醇代谢对罗非鱼渗透压调节的影响和相互作用研究还表明,仅在细胞经历600m Osm/kg的高渗胁迫时才开始累积兼容有机渗透物质,其中变化最显著就是肌醇,其胞内含量以及合成通路—MIB通路均在600m Osm/kg条件下出现显著的升高。过去的研究发现MI合成的底物来自于糖酵解的中间产物G6P,然而600m Osm/kg高渗胁迫下,胞内D-葡萄糖的含量与等渗对照中的无显著差异,且与肌醇同样显著高于800m Osm/kg极高渗胁迫下的胞内的含量。这可能意味着葡萄糖在细胞的高渗调节过程中还发挥着其他重要的功能。为了进一步探究糖代谢在鱼类高渗胁迫过程中发挥的作用,在活体罗非鱼上进行了急性盐度胁迫实验。对活体罗非鱼腹腔注射50 mg/m L的葡萄糖溶液,并将其置于16‰盐度的水中进行48 h的盐度胁迫,在随后的0、1、3、6、12、24、48 h七个时间点进行取样,对罗非鱼的糖代谢、肌醇代谢、离子转运能力等进行检测,探讨了糖代谢对罗非鱼应对高渗胁迫过程中肌醇代谢的作用。主要研究结果与结论如下:48 h的急性盐度胁迫显著提升了罗非鱼体内的肌醇合成通路—MIB通路的m RNA表达水平。其中的2种酶MIPS和IMPA1的基因表达水平在鳃、肾脏和肝脏中均出显著的上调,且在12 h左右表达水平最高。此外,肌醇的转运也被高渗胁迫显著性激活,其表达模式与MIB通路类似。相应地,肌醇在各组织内的积累量也有明显的变化,其中鳃和肾脏中有显著增加的趋势,而肝脏中无显著变化,在血清中则显著下降。提示肌醇在器官中的合成累积对于鱼类应对高渗胁迫发挥着重要的作用,其中,一部分肌醇由非渗透调节器官（肝脏等）合成,并转运至渗透调节器官（鳃、肾等）中。高渗胁迫显著提升了肝脏中的糖酵解和糖异生水平,而外源补充葡萄糖后又显著提升了这种变化。高渗胁迫显著提升了鳃离子转运相关的基因表达水平,而在此基础上注射葡萄糖,显著提升了鳃Na+/K+-ATPase的酶活性。除此之外,注射葡萄糖还显著降低了肝脏中Caspase-3的基因表达,有效缓解了高渗胁迫下的肝细胞凋亡,并显著降低了鳃、肾脏和肝脏中肌醇的合成和转运。以上结果表明,高渗胁迫下外源的葡萄糖补充,一方面可为机体提供所需的能量、并缓解肝细胞凋亡,另一方面可通过提升鳃的离子转运,以及本身作为兼容有机渗透物质来帮助鱼体应对高渗胁迫。综上,通过对细胞渗透调控过程的组学分析,发现PI3K-Akt、p53、HIF-1、Fox O、JAK-STAT和Hippo等信号通路均参与了高渗胁迫对细胞周期和细胞凋亡的调节;细胞在应对两种不同的高渗胁迫时所选择的策略也不同,在600m Osm/kg的高渗胁迫下,细胞更倾向于积累兼容有机渗透物质;而在800m Osm/kg的极高渗胁迫下,细胞更倾向于走向凋亡和坏死。由此可见,在高渗胁迫下,兼容有机渗透物质的积累至关重要。为了进一步探究糖代谢对鱼类应对高渗胁迫下兼容有机渗透物质—肌醇代谢的影响,在活体罗非鱼上进行了急性盐度胁迫实验。结果表明葡萄糖不仅作为兼容有机渗透物质为机体供能,同时还可以通过增强鱼类的离子转运能力来帮助机体应对高渗的胁迫。本研究对鱼类细胞应对不同程度高渗胁迫的调控机制进行了初步探讨,结果可为渗透压调节机制的深入研究提供参考,为缓解高渗胁迫功能添加剂的开发、推动咸水水域的水产养殖提供思路和借鉴。