论文部分内容阅读
研究背景：基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是一个锌离子依赖性的蛋白酶家族，在肿瘤的浸润、转移及血管新生过程中发挥着重要的作用。基质金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitorsofmatrixmetalloproteinases，TIMPs)是天然存在的MMPs内源性组织抑制剂。由于MMPs/TIMPs在肿瘤组织中呈现异常表达，TIMPs及人工合成型MMPs抑制剂已成为有希望的抗肿瘤药物。新近研究发现，MMPs/TIMPs平衡对于骨髓造血内环境稳态的维持也起着重要的作用，MMPs/TIMPs表达失衡参与了白血病的骨髓病理性血管新生及髓外浸润的过程。TIMP-3是一种结合于细胞外基质的特殊的MMPs天然抑制剂，可以通过抑制MMPs活性等机制抑制肿瘤的进展。目的：研究重组腺病毒介导的TIMP-3基因过表达对于人白血病细胞株K562的体外作用并探讨其对K562裸鼠移植瘤的抑制作用及作用机制。方法：应用RT-PCR的方法从胎盘组织中扩增TIMP-3cDNA序列，采用AdEasyTM系统构建重组腺病毒AdGFP、AdTIMP-3。流式细胞术检测其对人白血病细胞株K562及人脐静脉内皮细胞HUVECs感染效率，Westernblot检测重组腺病毒介导的TIMP-3在K562细胞及K562裸鼠移植瘤中的表达。以感染复数(multiplicitiesofinfection，MOI)为200的AdGFP、AdTIMP-3感染K562细胞，台盼蓝染色计数及CCK-8实验检测目的基因对K562细胞体外增殖能力的影响，并在基质膜胶覆盖Transwell迁移孔板中检测TIMP-3基因过表达对于K562细胞体外侵袭能力的影响。以200MOI的AdGFP、AdTIMP-3感染K562细胞，72h后收集条件培养基(conditionedmedium，CM)。用含体积分数为50％CM的培养基培养HUVECs，48小时后计数活细胞数检测TIMP-3在K562细胞培养上清中的表达对HUVECs促增殖作用的影响。Transwell迁移孔板中检测不同的CM在体外对HUVECs促迁移作用的影响。采用体外血管形成模型检测不同的CM在bFGF存在的前提下对于HUVECs体外管状结构形成的影响。以20MOI的AdGFP、AdTIMP-3体外直接感染HUVECs，明胶酶谱试验检测TIMP-3基因过表达对于内皮细胞明胶酶的表达及活化的影响。雌性5周龄Balb/C裸鼠皮下移植107K562细胞，分别于移植瘤内注射AdGFP、AdTIMP-3及PBS，其后第5及第10天重复治疗。21天后处死裸鼠，剥离瘤块进行组织学检查。结果：自胎盘组织中扩增出676bpTIMP-3cDNA连接入穿梭质粒中，构建重组腺病毒。AdTIMP-3经扩增纯化后滴度达到1.25×1011PFU/mL，对照病毒AdGFP为8×1010PFU/mL。K562细胞及HUVECs的最佳MOI分别为200和20，感染效率达到80％。Westernblot试验在AdTIMP-3感染的K562细胞培养上清及裸鼠AdTIMP-3治疗组的肿瘤裂解液中均可以检测到糖基化和非糖基化的TIMP-3蛋白表达。与对照组相比，AdTIMP-3感染并不影响K562细胞的增殖但可显著抑制其穿过ECM胶的侵袭能力(P＜0.01)。台盼蓝排斥试验计数结果表明，与K562对照细胞及Ad-GFP感染的K562细胞来源的条件培养上清相比，AdTIMP-3感染的K562细胞来源的条件培养基对HUVECs的促增殖作用下降了1.85倍，对HUVECs的迁移诱导能力下降了2倍，并明显抑制了HUVECs的体外管状结构形成能力。明胶酶谱分析证明AdTIMP-3直接感染HUVECs可以下调VEGF刺激的其MMP-2的表达与激活。治疗3周后AdTIMP-3治疗组移植瘤体积(910.74±158mm3)远小于AdGFP组(2440.71±521.62mm3)及PBS对照组(2553.67±548.49mm3)。肿瘤组织H&E染色显示AdTIMP-3治疗组肿瘤有大片的坏死灶；免疫组化CD31染色显示每×200倍视野中AdTIMP-3组、AdGFP组及PBS对照组肿瘤微血管数分别为11.2±2.3、29.2±5.2和29.8±4.8；肿瘤组织中SMA免疫组化染色显示每×200倍视野中AdTIMP-3组、AdGFP组及PBS对照组每×200倍视野中阳性细胞数分别为3.2±1.2、10.2±2.4和10.6±1.9；TUNEL显示AdTIMP-3治疗组的肿瘤组织中的肿瘤细胞凋亡水平显著增高。结论：重组TIMP-3腺病毒感染显著抑制白血病细胞株K562的侵袭能力但对于其体外增殖并没有抑制作用，TIMP-3的过表达可以显著抑制K562细胞条件培养基对于内皮细胞的增殖、迁移和体外管状形成能力的促进作用，AdTIMP-3治疗可通过抑制移植瘤内血管新生及成熟而导致肿瘤细胞的凋亡，从而显著抑制K562细胞移植瘤在裸鼠体内的生长。结果证明，重组TIMP-3腺病毒可以抑制白血病细胞的侵蚀性并通过抑制白血病血管新生与成熟而达到抑制白血病移植瘤的作用，有望成为治疗造血系统恶性肿瘤、抑制白血病髓外浸润的一种有效的基因治疗药物。