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目的:检测高糖诱导的肾小管上皮细胞中miR-27a是否通过调控Sfep1的表达进而活化Wnt/β-catenin信号通路,最终促进DN肾脏纤维化的发生发展,进一步为深入理解DN肾脏纤维化的发病机制及改善DN的治疗方案提供新的实验依据。方法:1.12只健康清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为糖尿病肾病(DN)组与正常对照(NC)组,每组6只。造模成功10周后乙醚麻醉处死,股动脉取血检测相关生化指标;HE、Masson染色观察大鼠肾组织病理学改变;利用免疫组织化学检测各组大鼠肾组织中β-catenin及Sfrp1蛋白的定位及表达;Western blot检测col-Ⅲ、col-Ⅳ、E-cadherin、α-SMA蛋白表达变化及Wnt/β-catenin信号通路相关分子的表达变化;利用qRT-PCR检测各组大鼠肾组织中Sfrp1及miR-27a的mRNA表达水平;2.将肾小管上皮细胞(NRK-52E)分为正常糖(NG 5.5mmol/L)和高糖(HG 30mmol/L)组,利用免疫荧光检测col-Ⅳ、E-cadherin、α-SMA、β-catenin、Sfip1蛋白表达变化;利用Western blot检测col-Ⅲ、col-Ⅳ、E-cadherin、α-SMA蛋白表达变化及Wnt/β-catenin信号通路相关分子的表达变化;利用qRT-PCR检测各组NRK-52E细胞中Sfrp1及miR-27a的mRNA表达情况;3.将高糖培养的NRK-52E细胞,分别转染miR-27amimics(miR-27a过表达组;miR-27a m)、miR-27a mimics negative control(miR-27a mimics阴性对照组;miR-27a mnc)、miR-27a inhibitors(miR-27a抑制剂组;miR-27a i),miR-27a inhibitors negative control(miR-27a inhibitors阴性对照组;miR-27a inc);利用Western blot检测各组细胞中Sfip1的表达变化;利用qRT-PCR技术观察miR-27a、Sfip1的表达变化。4.通过生物信息学软件TargetScan和miRanda预测miR-27a与Sfip1 mRNA 3’UTR的结合位点,利用荧光素酶报告基因检测验证miR-27a与Sfip1的相互作用。5.将高糖培养的NRK-52E细胞分别转染miR-27a inhibitors及其阴性对照,si-Sfrp1、si-Sfrp1+miR-27a inhibitors及其阴性对照(control组),利用免疫荧光、Western blot、qRT-PCR检测E-cadherin、α-SMA、col-IV的表达变化及Wnt/β-catenin信号通路相关分子表达变化。结果:1.生化指标、肾组织形态学变化结果显示DN大鼠模型复制成功;免疫组化结果示:DN组大鼠肾组织中β-catenin表达明显增多,且发生了核转移,而Sfrp1主要表达在细胞胞浆中,且DN组Sfrp1蛋白表达水平较NC组明显减少;Western blot结果示:DN组大鼠肾组织中col-Ⅲ、col-Ⅳ、α-SMA、β-catenin,p-GSK3βser9蛋白的表达较NC组明显增多(P<0.05),而DN组大鼠肾组织中E-cadherin、Sfrp1蛋白的表达较NC组明显减少(P<0.01),GSK3β未见明显变化;qRT-PCR结果示DN组大鼠肾组织中Sfrp1mRNA水平较NC组减少(P<0.05);miR-27a的表达水平较NC组显著增加(P<0.01)。2.高糖培养的NRK-52E细胞中,免疫荧光结果示:col-Ⅳ、α-SMA、β-catenin在HG组的荧光强度明显高于NG组,且β-catenin有核转移现象的发生,而E-cadherin、Sftp1荧光强度较NG组显著较弱;Western blot 结果示:HG组col-Ⅲ、col-Ⅳ、a-SMA、β-catenin,p-GSK3βser9蛋白的表达较NG组明显增多(P<0.05)，而HG组E-cadherin、Sfrp1蛋白的表达较NG组明显减少(P<0.05),GSK3β未见明显变化;qRT-PCR结果示HG组NRK-52E细胞中Sfrp1mRNA水平较NG组减少(P<0.05),miR-27a的表达水平较NG组显著增加(P<0.01)。3.与miR-27amnc比较,转染rmiR-27amimics组miR-27a表达水平明显增多(P<0.05),Sfrp1蛋白与mRNA的表达水平明显减少(P<0.05);与miR-27ainc比较,miR-27a inhibitors组miR-27a表达水平明显减少CP<0.05),而Sfrp1蛋白与mRNA的表达水平明显增多(P<0.05)。4.荧光素酶报告基因检测显示miR-27a能够靶向调控Sfrp1 mRNA 3’UTR。5.miR-27a inhibitors组α-SMA、col-Ⅳ蛋白及mRNA表达水平较miR-27a inc组明显减少(P<0.05),而E-cadherin蛋白及mRNA表达水平明显增加(p<0.05);si-Sfrp1组α-SMA、col-Ⅳ蛋白及mRNA表达水平较control组明显增多(P<0.05),但较si-Sfrpl+miR-27a inhibitors组α-SMA、col-Ⅳ蛋白及mRNA表达水平有所减少,而E-cadherin表达水平有所增加(P<0.05);miR-27a inhibitors组Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白分子β-catenin,p-GSK3βser9蛋白的表达水平较其对照组明显减少(P<0.05),GSK3β未见明显变化;si-Sfrp1组β-catenin和p-GSK3βser9蛋白表达水平较对照组明显增多(P<0.05),但较si-Sfrp1+miR-27a inhibitors组明显减少(P<0.05)。结论:1.高糖环境下,Sfrp1表达下调,miRNA-27a表达增加,且miRNA-27a通过与Sfrp1的3’ UTR结合抑制其表达。2.miR-27a可以通过抑制Sftp1的表达活化Wnt/β-catenin信号通路进而促进肾脏纤维化的发生。