【摘 要】
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地衣芽胞杆菌是一种革兰氏阳性、内生孢子形成的美国FDA公认安全型菌株（GRAS）,具有很高的生物技术价值和潜在的用途。同时菌株具有强大的蛋白胞外分泌能力,使其成为异源蛋白表达的优秀宿主。但是其还存在部分外源蛋白难以分泌,蛋白转运系统开发不完全等问题。本研究基于这些问题,以Sec途径不能成功分泌的胞内酶精氨酸酶为目标产物,对地衣芽胞杆菌Tat转运途径进行系统性的改造,成功构建了针对不同类型Tat信号
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地衣芽胞杆菌是一种革兰氏阳性、内生孢子形成的美国FDA公认安全型菌株（GRAS）,具有很高的生物技术价值和潜在的用途。同时菌株具有强大的蛋白胞外分泌能力,使其成为异源蛋白表达的优秀宿主。但是其还存在部分外源蛋白难以分泌,蛋白转运系统开发不完全等问题。本研究基于这些问题,以Sec途径不能成功分泌的胞内酶精氨酸酶为目标产物,对地衣芽胞杆菌Tat转运途径进行系统性的改造,成功构建了针对不同类型Tat信号肽并高效表达胞外蛋白的宿主菌0F8D/Y,大幅提升精氨酸酶的分泌表达水平,本研究初步获得了能够高效分泌精氨酸酶的Tat表达系统,该系统对分泌其他结构复杂的蛋白质也有潜在的应用价值。精氨酸酶是地衣芽胞杆菌自身的一种细胞质酶,需要在细胞质内与辅因子结合并形成六聚体稳定构象才能发挥活性作用,本研究选用地衣芽胞杆菌Sec途径信号肽SacCsp和Tat途径信号肽PhoDsp、YwbNsp表达精氨酸酶,结果表明Sec系统不能有效分泌该酶,而Tat转运途径能成功分泌有活性的精氨酸酶。随后,我们选用了四种地衣芽胞杆菌自身经典Tat途径信号肽PhoDsp、YwbNsp、YkuEsp和QcrAsp,及四种大肠杆菌Tat途径信号肽Ami Asp、TorAsp、MdoDsp和DmsAsp,筛选出五种能表达具有活性的精氨酸酶的信号肽PhoDsp、YwbNsp、AmiAsp、TorAsp和Mdo Dsp,精氨酸酶酶活分别为96.35 U/m L、110.77 U/m L、112.14 U/m L、111.41U/m L和106.30 U/m L。信号肽酶负责信号肽的切除并将有活性的蛋白质释放到胞外,因此信号肽酶在蛋白质跨膜运输过程中至关重要。本研究通过强化表达地衣芽胞杆菌自身的四个信号肽酶基因sip S,sip T,sip W,sip V,筛选出信号肽酶Sip S,此信号肽酶有助于释放成熟蛋白质,提高胞外蛋白的分泌效率,最后使得Tat Ad Cd途径特异性信号肽Pho Dsp和Tat Ay Cy途径特异性信号肽AmiAsp介导表达的精氨酸酶活力提高到166.59 U/m L和418.12 U/m L。Tat系统转运完全折叠的蛋白质,而在蛋白质折叠的过程中,分子伴侣是帮助蛋白质折叠的一个重要因素。本研究通过敲除分子伴侣基因表达抑制因子HrcA,使PhoDsp、TorAsp、AmiAsp和YwbNsp分泌表达的精氨酸酶酶活均得到大幅提升,达到了295.22 U/m L、313.60 U/m L、341.65U/m L和274.82 U/m L。Tat转位酶在细胞膜中的低丰度是Tat转运系统分泌能力弱的一个限制因素,本研究通过对Tat转位酶tat Ad Cd和tat Ay Cy进行整合表达,提升其在细胞膜中的丰度,解除Tat转位酶与蛋白结合易饱和的限制,使得PhoDsp、TorAsp、AmiAsp和YwbNsp介导表达的精氨酸酶酶活同样大幅提升,分别为211.32 U/m L、291.95U/m L、418.12 U/m L和380.71 U/m L。最后,本研究将这三个因素进行组合优化,获得最终叠加工程菌株0F8D/Y（0F3::sipS△hrc A::tatAdCd/tatAyCy）,将表达质粒pHY-Pho Dsp-rocF和pHY-TorAsp-rocF转化到0F8D中,将pHY-AmiAsp-rocF和pHY-YwbNsp-rocF转化到0F8Y中,使PhoDsp、TorAsp、AmiAsp和Ywb Nsp介导表达的精氨酸酶酶活都达到本研究最高水平,分别达到了350.61 U/m L、420.98 U/m L、532.62 U/m L和576.68 U/m L。综上,本研究通过对地衣芽胞杆菌Tat转运系统进行从信号肽酶到分子伴侣到Tat转运组分的多层调节优化,从而建立了一个高效分泌精氨酸酶的Tat表达平台,该平台表达的精氨酸酶可用于工业生产鸟氨酸。本研究是对地衣芽胞杆菌Tat途径的第一次系统改造,使得Tat转运系统可用于高产胞外精氨酸酶,并且该高效平台也有望用于其他结构复杂的胞内蛋白的生产,为工业上高产蛋白质提供了新策略。
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