花生膜联蛋白家族基因分析和功能研究

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花生是世界范围内广泛种植的油料和经济作物之一,在国民经济中占有重要地位。花生产地主要集中在干旱及半干旱地区,不良环境气候严重影响了花生产量和品质。早期花生抗逆性研究主要集中在耐盐性综合评价及耐盐种质筛选等方面,而有关花生耐盐机理方面的研究较少。研究表明,膜联蛋白(annexin)在植物生长发育和抗逆性方面具有重要作用,但是到目前为止,有关该家族基因在花生抗逆中的研究甚少。本文首先在全基因组水平对花生中所有膜联蛋白基因家族成员的基因结构、组织特异性表达模式以及在不同胁迫处理下的表达模式进行了分析,又从“丰花1号”花生品种中克隆了 7个annexin基因,并从表达模式、花生与拟南芥的遗传转化、原核诱导表达以及亚细胞定位等方面进行了功能分析。主要结果如下:(1)花生基因组中30个annexin(annexin of Arachis hypogaea,AnnAh)基因的生物信息学分析。30个AnnAhs不均匀分布在13条染色体上,其中A、B基因组中分别有13个和17个。AnnAhs含有2~8个内含子,多数含有5~6个内含子。他们均无跨膜结构域,16个AnnAhs定位于细胞质,其余定位不明确。可变剪切分析结果显示,仅有11个发生可变剪切事件,占38%;根中发生的最多,其次是叶中,种子中最少。表达模式分析发现,AnnAhs主要在seed2和根中表达量较高,其次是seed1,在叶中表达量较低。AnnAh基因克隆与序列分析。从“丰花1号”中克隆了 7个annexin基因,分别命名AnnAh11、AnnAh12、AnnAh13、AnnAh14、AnnAh15、AnnAh16和AnnAh17。跨膜结构预测结果表明,7个AnnAhs均无跨膜结构;亚细胞定位预测结果显示,AnnAh1 4~17定位在细胞质中,AnnAh1 1~13定位不明确;理化性质分析结果显示,AnnAhs的蛋白分子量在34.96-36.37 KDa,等电点在6.87~9.26之间,带正电荷的氨基酸(Asp+Glu)具有36~49个,带负电荷的氨基酸(Arg+Lys)具有42~52个;其不稳定系数在33.41~48.06,属于稳定蛋白质;亲水性平均系数为-0.355~-0.521,属于可溶性的亲水性蛋白。基因结构分析表明,AnnAh11和AnnAh12有5个外显子和4个内含子;AnnAh13、AnnAh14、AnnAh15、AnnAh16和AnnAh17含有6个外显子和 5 个内含子。AnnAh11基因的内含子序列较长,AnnAh12次之,其余5个内含子序列较短。(2)表达模式分析。①不同胁迫处理下的表达模式分析。1%NaCl、20%PEG6000、20 mg·L-1 ABA、]%H2O2、125 mg·L-1茉莉酸甲酯(MJ)、1.0 mmol·L-1 SNP、37℃高温及4℃低温处理24 h。结果表明,AnnAhs对H2O2、MJ、ABA、高温及低温的胁迫响应明显,而对PEG6000、NaCl、SNP胁迫处理响应不明显,并且AnnAhs在根和叶中的表达模式不同,各个AnnAh差异表达。②AnnAhs的组织特异性表达模式分析。结果表明,AnnAh11和AnnAh12在花和根中表达,在茎、叶及种子中无表达。AnnAh13~17在五个组织中均表达且差异表达。③盐胁迫下的表达模式分析。200 mmol·L-1 NaCl处理,分别于0h、1h、6h、12 h、24 h和48 h取样。结果表明,AnnAhs在根中差异表达。AnnAh11和AnnAh12表达量先升后降,12 h时达到最高;AnnAh13的表达量均低于对照;AnnAh14/15的表达量呈上升趋势;AnnAh16/17的表达量呈降低-升高-降低趋势。7个AnnAhs在叶中的表达模式基本一致,均在12 h时和48 h时出现2次高峰。④ABA胁迫处理下的表达模式分析。20 mg.L-1 ABA处理,分别于0h、1h、6h、12h、24 h和48 h取样。结果表明,7个AnnAhs在根中的表达模式各不相同,AnnAh11和AnnAh12的表达量均在ABA处理后逐渐上升,6h达到最高点,其后逐渐下降;AnnAh13在处理1h后逐渐升高;AnnAh14/15随着ABA胁迫时间的延长,表达量逐渐增加;AnnAh16/17在1h表达量最低,24 h最高。7个AnnAhs在叶中的表达模式基本一致,在ABA胁迫处理1h后升高,然后降低,在24 h降到最低值。(3)对5个AnnAhs基因构建了植物表达载体pR1101-AN,完成了花生及拟南芥遗传转化,通过抗性筛选和分子检测,在花生中获得T0代转基因植株:AnnAh11转基因苗10棵,AnnAh12转基因苗4棵,AnnAh13转基因苗2棵,AnnAh14转基因苗0棵,AnnAh15转基因苗5棵。拟南芥T0代转基因株系分别是3棵、5棵、2棵、4棵和3棵。(4)通过对它们的SUMO化位点预测,发现AnnAh16和AnnAh17具有SUMO化位点,于是对其构建了原核表达载体pET-28a(+),并进行了 IPTG原核诱导表达,AnnAh17在原核细胞中成功表达。成功构建了AnnAh16的原核表达载体pCDFDuet。对AnnAh11~15构建了亚细胞定位载体pBSK+-35S-EGFP。
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