论文部分内容阅读
ABI5（ABA insensitive 5）亚家族转录因子参与调控植物的生长发育过程以及对不同胁迫的响应。在无ABA情况下,因转录活性抑制区域的存在,过表达全长ABI5亚家族成员的转基因植株常常性状不够明显,也常有ABI5亚家族各成员作为下游基因的负调节因子或超表达植株的表型变化不一致的报道。ABI5亚家族转录因子在氨基酸序列上高度保守,根据其保守性及先前的研究显示ABI5亚家族9个成员的保守区II（CRII）均具有转录激活活性且DPBF4 CRII的转录激活活性最强,ABI5保守的磷酸化位点又对其转录激活活性有明显的抑制作用。据此我们去除各成员的转录抑制区域,选用DPBF4CRII和其他各成员的DNA结合域构建活性形式的重组转录因子,在拟南芥中超表达后筛选具有稳定遗传表型的转基因植株,通过各超表达植株的表型变化及组学测序分析,以期了解ABI5亚家族9个成员在植物生长发育过程中调控的生长表型及其分子机制,明确各成员精细的生物学功能。本论文的主要研究结果如下:（1）构建完成了ABI5亚家族中DBBF2、DBBF3、DBBF4、DBBF5及At5G42910重组遗传转化载体p1304-4IID2bZIP、p1304-4IID3bZIP、p1304-4IID4bZIP、p1304-4IID5bZIP及p1304-4II 910bZIP。（2）将p1304-4IID2bZIP、p1304-4IID3bZIP、p1304-4IID4bZIP、p1304-4IID5bZIP及p1304-4II910bZIP重组遗传转化载体进行农杆菌转化后花序浸染野生型拟南芥,获得超表达转基因植株A.thaliana 910共6个株系、A.thaliana D3共8个株系,A.thaliana D5共5个株系,均已完成筛选传代得到了T1代种子（目前正在进行T2代的筛选传代）,A.thaliana D2和A.thaliana D4均已筛选到10个转基因株系,正在进行T1代的筛选传代。（3）构建完成了ABI5亚家族9成员酵母双杂交载体AD/BD-ABF1bZIP、AD/BD-ABF2bZIP、AD/BD-ABF3bZIP、AD/BD-ABF4bZIP、AD/BD-ABI5bZIP、AD/BD-DBBF2bZIP、AD/BD-DBBF3bZIP、AD/BD-DBBF4bZIP及AD/BDAt5G42910bZIP。（4）通过酵母双杂交系统分析了ABI5亚家族9个成员可以形成的所有同源/异源二聚体模式。结果表明,这9个成员中仅ABF3和ABI5可以形成同源二聚体;ABI5和ABF2、ABF4之间可以形成异源二聚体,ABF1和ABI5也可以形成微弱的异源二聚体。（5）对重组ABI5（ABI5CRII-ABI5bZIP）超表达株系A.thaliana MX-1-1、超表达ABI5全长株系A.thaliana MX-4-4通过q RT-PCR检测了ABA信号通路中受ABI5调控的下游基因的表达。结果表明,随着幼苗生长,相较于野生型,ABI5和RD29A的m RNA表达量在A.thaliana MX-1-1中显著上调,在24天龄的幼苗时分别上升了246和1.8倍,而在A.thaliana MX-4-4中,ABI5至培养14天龄的幼苗中先上调了47倍,随着植物的生长发育在24天龄的幼苗中又下降至野生型的0.2倍,RD29A则在24天龄的幼苗中下降至野生型的0.6倍;FLC、SHB1、RD29B、At EM1和At EM6表达量在A.thaliana MX-1-1中和A.thaliana MX-4-4中随着幼苗的生长发育先上调后下降:在A.thaliana MX-1-1和A.thaliana MX-4-4中,FLC的m RNA表达量在14天龄的幼苗中分别上升了约6倍和10倍,24天龄的幼苗中又分别下降至野生型的0.3倍和0.1倍;SHB1的m RNA表达量在14天龄的A.thaliana MX-1-1中上升了2.5倍,在24天龄幼苗中的表达量与野生型无显著差异,在14天龄的A.thaliana MX-4-4中上升了3.5倍,在24天龄的幼苗中下降到野生型的0.4倍;A.thaliana MX-1-1中RD29B的m RNA表达量无显著变化,在24天龄的A.thaliana MX-4-4中RD29B的表达量下降至0.6倍;At EM1和At EM6表达量则在14天龄的A.thaliana MX-1-1中均上调了5倍左右,在24天龄时又分别下调至与野生型无显著差异,而两者在14天龄的A.thaliana MX-4-4中分别上调了约9倍和11倍,至24天龄时又均下调至野生型的0.2倍。以上这些结果表明在A.thaliana MX-4-4中这些相关基因的下调更为显著。（6）A.thaliana MX-1-1的蛋白质组学结果表明,相较于野生型,超表达转基因株系A.thaliana MX-1-1中共检测到35个差异蛋白,参与ABA合成代谢、免疫应答以及能量代谢等生物学过程。活性ABI5通过参与ABA的生物合成与代谢、GA信号途径等调控植物的生长发育。