奶牛泌乳能力和乳品质是评价奶牛经济价值的关键因素,但乳品质易受多种条件影响。课题组前期研究发现饲喂玉米秸秆饲料会导致荷斯坦奶牛乳腺组织内IFN-γ受体表达升高,IFN-γ含量升高,诱导奶牛乳腺上皮细胞（Bovine mammary epithelial cells,BMECs）精氨酸耗竭和自噬,从而降低乳品质、增加奶牛乳腺炎的发生。但是IFN-γ诱导精氨酸耗竭的机制知之甚少。前期转录组学数据提示线粒体半胱氨酰tRNA合成酶2（Cysteinyl-tRNA synthetase 2,CARS2）可能是介导IFN-γ调节精氨酸代谢的关键蛋白。因此本课题围绕CARS2在IFN-γ诱导奶牛乳腺上皮细胞MAC-T精氨酸耗竭中的作用、机制开展工作,为人工干预营养代谢、提升乳品质量,预防及治疗因精氨酸缺乏导致的各种疾病提供了一定的理论基础。为明确CARS2参与IFN-γ诱导精氨酸耗竭,采用q PCR、Western blotting检测IFN-γ作用后CARS2在细胞的表达;ELISA检测CARS2的酶活力及胞内精氨酸的含量;高效液相色谱质谱联用（HPLC-MS）检测细胞氨基酸代谢。结果显示,10 ng/m L IFN-γ作用后,原代BMECs及可传代BMEC MAC-T CARS2 m RNA及蛋白水平表达均降低,而酶活力无显著变化,无IFN-γ刺激下,CARS2敲降（Sh-CARS2）后精氨酸含量显著降低;添加IFN-γ及敲降CARS2后胞内精氨酸、瓜氨酸含量均降低,胍丁胺含量均升高。为了解CARS2对精氨酸代谢关键酶的调节,通过Western blotting和ELISA检测精氨酸合成关键酶-精氨酸代琥珀酸合成酶1（Argininosuccinate synthase 1,ASS1）、鸟氨酸氨甲酰基转移酶（Ornithine transcarbamoylase,OTC）,精氨酸分解关键酶-精氨酸脱羧酶（Arginine decarboxylation,ADC）的含量及酶活力。结果显示,添加IFN-γ及敲降CARS2均可以下调原代BMECs与MAC-T细胞ASS1、OTC的表达,上调ADC的表达,同时上调MAC-T细胞内ADC的酶活性,下调OTC的酶活性,从而加速催化精氨酸的分解,抑制精氨酸的合成过程。为揭示IFN-γ作用下CARS2抑制MAC-T细胞ASS1合成的信号通路,通过体外添加小分子信号通路抑制剂,荧光定量PCR及蛋白免疫印迹检测MAPK信号通路中的p38、ERK、JNK的变化。发现IFN-γ可以激活p38、JNK分子,抑制ERK分子的表达,而p38、JNK分子的激活或ERK分子的抑制又可以进一步抑制CARS2、ASS1的转录和翻译水平的表达,因此确定IFN-γ通过p38/JNK及ERK MAPK调节其下游的CARS2、ASS1分子,最终导致ASS1的缺乏,无法合成充足的精氨酸。为探究CARS2对BMECs增殖周期及细胞自噬的影响,通过CCK-8活力检测、平板克隆试验等实验发现,抑制CARS2并不能显著改变MAC-T的生长活力,但可以促进恶性增殖BMECs的克隆生长。敲降CARS2后,恶性增殖BMECs内周期蛋白Cyclin A1、D1表达升高。结合q PCR、免疫荧光发现,干扰CARS2后LC3A/B、ATG5蛋白表达显著升高,p62、Beclin-1表达显著下调,表明抑制CARS2可能促进细胞增殖,诱导细胞自噬。综上所述,本研究证实CARS2介导IFN-γ诱导的奶牛乳腺上皮细胞精氨酸耗竭,其机制是IFN-γ通过p38/JNK/ERK MAPK信号通路抑制CARS2表达,下调OTC-瓜氨酸-ASS1通路,抑制精氨酸的合成,并上调ADC-胍丁胺促进精氨酸的分解。本研究为防治炎症因子引起的精氨酸代谢相关疾病提供了基础和思路。