背景和目的肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤性疾病之一,吸烟及环境污染是肺癌的主要诱发因素。近年来随着我国环境污染的日趋严重,在男性病人中,肺癌的发病率和死亡率不断上升,居于男性恶性肿瘤之首;在女性病人中,肺癌的发病率和死亡率仅次于乳腺癌。而肺癌早期诊断困难,多数肺癌明确诊断时已是晚期,错失手术根治机会,且肺癌术后存活率低,复发率高,给民众的身心健康带来了巨大的损害。依据病理分类,肺癌包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌两大肿瘤类型。前者是最常见的类型,包括肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌等类型,约占肺癌的80%。一直以来,化疗都是非小细胞肺癌主要的治疗方法之一,但非小细胞肺癌对其敏感性通常较差。虽然近年来靶向药物在非小细胞肺癌的治疗中取得了一些进展,但并没有明显改善多数患者的预后。因此,对非小细胞肺癌发病机制与治疗方法的研究就显得尤为重要。肿瘤的发生、发展及治疗均受到复杂的分子机制的调控和影响。微小RNA（microRNA,miRNA）是一组内源性非编码小分子RNA,长度多为19-25个碱基,与多种恶性肿瘤的发生、发展有关。研究发现,miR-34b-3p在肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌等多种实体肿瘤以及血液系统恶性肿瘤中表达水平降低,有可能参与调控肿瘤细胞的生物学行为。TGFBR1又称转化生长因子β受体1型,通过信号转导把信号从细胞的表面传递到细胞内,细胞外的环境通过这种信号转导影响细胞内的活动,比如刺激肿瘤细胞的生长和分裂,而下调TGFBR1可以抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭,促进肿瘤细胞的凋亡。近些年,天然化合物在肿瘤疾病中的作用受到人们的重视。比如生物碱酰胺类化合物、黄芩素、杨梅黄铜等,这些天然化合物可以通过各种不同的机制作用于肿瘤的发生、发展,有些也可以影响化疗药的抗肿瘤效果。这些天然化合物为肿瘤的治疗提供了不同的方法和思路。荜茇酰胺（Piperlongumine,PL,又名荜茇明宁碱,3,4,5-三甲氧基肉桂酰环己酰胺）是生物碱酰胺类化合物的一种,提取自瘤突胡椒、荜茇、长胡椒等胡椒科植物的根和果实中。近年的研究表明,PL可以通过多种途径发挥抗肿瘤作用。目前,关于PL在肺癌中的作用研究很少,尤其是其对miRNA的作用研究更少。因此,本文研究了 PL能否对非小细胞肺癌的增殖、侵袭产生影响,并研究其可能的信号通路。本研究分为三部分研究PL在非小细胞肺癌中的作用机制:第一部分,PL对非小细胞肺癌细胞miRNA表达的影响;第二部分,PL及miR-34b-3p对非小细胞肺癌增殖、侵袭、凋亡的影响;第三部分,PL通过miR-34b-3p调控非小细胞肺癌生物学机制的初步研究。第一部分 荜茇酰胺对非小细胞肺癌细胞miRNA表达的影响方法1.采用 CCK-8 测定不同浓度的 PL（0 μmol/L、2μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L）对人正常支气管上皮NHBE细胞和非小细胞肺癌A549、H1299、H520、SPC-A-1细胞的细胞毒作用。2.分别用 10 μmol/L PL 和 0.1%DMSO（0μmol/L PL）处理 A549 细胞,24 小时后提取RNA,应用miRNA基因芯片技术检测PL处理的A549细胞中miRNA的表达情况,分析差异性表达的miRNA。3.使用 GeneSpring13.1 软件及 3 个数据库 Target Scan、PITA、microRNAorg对miR-34b-3p的靶基因进行预测,这三个数据库进行取交集,得到共同的基因,进GO分析和KEGG分析。4.采用qRT-PCR的方法检测PL对多种非小细胞肺癌A549、H1299、H520、SPC-A-1细胞中miR-34b-3p表达水平的影响。结果1.非小细胞肺癌细胞和人正常支气管上皮NHBE细胞对PL处理的反应不同,10μmol/LPL可显著抑制非小细胞肺癌A549、H1299、H520、SPC-A-1细胞的活力（P＜0.05）,PL 对非小细胞肺癌 A549、H1299、H520、SPC-A-1 细胞有明显的剂量依赖性细胞毒作用,而NHBE细胞在高浓度的PL作用下才显示出轻微的毒性作用。2.miRNA基因芯片技术检测分析出74个miRNA在PL刺激的非小细胞肺癌A549细胞中差异性表达,其中27个miRNA表达上调,47个miRNA表达下调。miR-34b-3p在PL刺激的A549细胞中呈高表达（P＜0.05）。3.GO分析和KEGG分析显示,PL参与调控了 A549细胞的多种生物学过程。4.qRT-PCR 结果显示,10 μmol/L PL 可以刺激 A549、H1299、H520、SPC-A-1多种非小细胞肺癌细胞中miR-34b-3p的表达上调（P＜0.05）。第二部分 荜茇酰胺及miR-34b-3p对非小细胞肺癌增殖、侵袭、凋亡的影响方法1.使用脂质体 2000 转染 miR-34b-3p mimics/scramble,设立 miR-34b-3p 组、miR-NC组,qRT-PCR方法检测miR-34b-3p的表达水平。2.qRT-PCR 方法检测检测四组（PL 0 μmol/L 组、PL 10 μmol/L 组、miR-34b-3p组、miR-NC 组）A549、H1299 细胞中 TGFBR1、MMP2、TIMP1 mRNA 的表达水平。3.在0h、24 h、48 h、72 h四个时间点,应用CCK-8检测四组A549、H1299细胞的OD值,A549、H1299细胞的细胞活性以OD值来表示,根据不同时间点的OD值绘制出生长曲线。4.Transwell实验检测四组A549、H1299细胞的穿膜细胞数,评价10μmol/L PL和miR-34b-3p对A549以及H1299细胞侵袭能力的影响。5.Western blot检测四组A549、H1299细胞中TGFBR1及侵袭相关蛋白MMP2、TIMP1的表达水平。6.划痕实验检测10 μmol/L PL和miR-34b-3p对A549以及H1299细胞迁移能力的影响。7.流式细胞术、Caspase3/7活性检测10 μmol/L PL和miR-34b-3p对A549以及H1299细胞凋亡的影响。8.将三组（miR-34b-3p组、miR-NC组和PL组）A549细胞分别注射到对应组BALB/c裸鼠肩胛背部皮下,建立裸鼠移植瘤模型,每周测量肿瘤体积。4周后处死裸鼠,剥离肿瘤称重。称重后,将瘤体取材切片进行Ki-67染色及TUNEL检测,观察10 μmol/L PL和miR-34b-3p对移植瘤生长的影响。结果1.qRT-PCR结果显示,在非小细胞肺癌A549及H1299细胞,与miR-NC组相比,miR-34b-3p组的miR-34b-3p的表达水平都明显升高（P＜0.05）。2.TGFBR1及侵袭相关蛋白MMP2、TIMP1 mRNA表达水平检测结果显示,与 PL 0μmol/L 组相比,PL 10 μmol/L 组 TGFBR1、MMP2 与 TIMP1 mRNA的相对表达水平显著下降（P＜0.05）;与miR-NC组相比,miR-34b-3p组TGFBR1、MMP2与TIMP1 mRNA的相对表达水平亦显著下降（P＜0.05）。3.CCK-8实验结果显示,与PL 0 μmol/L组相比,PL 10 μmol/L组可降低A549及H1299细胞的OD值（P＜0.05）;与miR-NC组相比,miR-34b-3p组亦可降低A549及H1299细胞的OD值（P＜0.05）,即10 μmol/L的PL及miR-34b-3p均可抑制A549、H1299细胞的增殖。4.Transwell结果显示,与PL 0 μmol/L组相比,PL 10 μmol/L组可降低穿膜细胞数（P＜0.05）;与miR-NC组相比,miR-34b-3p组亦可降低穿膜细胞数（P＜0.05）,即 10 μmol/L 的 PL 及 miR-34b-3p 均有效抑制 A549、H1299细胞的侵袭能力。5.Western blot结果显示,与PL 0 μmol/L组相比,PL 10 μmol/L组可显著降低TGFBR1及侵袭相关蛋白MMP2、TIMP1的表达（P＜0.05）;与miR-NC组相比,miR-34b-3p组亦可降低TGFBR1及侵袭相关蛋白MMP2、TIMP1的表达（P＜0.05）。6.划痕实验结果显示,miR-34b-3p组与PL 10 μmol/L组伤口愈合距离较miR-NC组宽,表明应用PL处理与上调miR-34b-3p均可抑制A549和H1299细胞的迁移能力。7.流式细胞术结果显示,与PL 0μmol/L组相比,PL 10μmol/L组可增加非小细胞肺癌A549、H1299细胞的凋亡数量（P＜0.05）;然而,与miR-NC组相比,miR-34b-3p组却没有明显的促凋亡效应。Caspase3/7活性检测结果同样表明,PL 10μmol/L组可提高Caspase3/7的相对活性（P＜0.05）,而miR-34b-3p组却无此作用。8.裸鼠移植瘤体内实验结果显示,PL组和miR-34b-3p组细胞接种的裸鼠移植瘤体积、重量均较miR-NC组低（P＜0.05）;并且,PL组和miR-34b-3p组移植瘤组织的Ki-67阳性染色明显低于miR-NC组（P＜0.05）;然而Tunel染色显示,PL组的凋亡细胞数明显高于miR-NC组和miR-34b-3p组。第三部分荜茇酰胺通过miR-34b-3p调控非小细胞肺癌细胞生物学机制的初步研究方法1.应用生物信息学软件筛选miR-34b-3p的靶基因。2.双报告基因实验检测miR-34b-3p的靶基因。设计野生型和突变型TGFBR1双报告基因载体,将miR-34b-3p mimics/scramble和野生型或突变型TGFBR1载体共转染,检测荧光素酶荧光强度变化。3.Western blot检测调控miR-34b-3p对靶基因TGFBR1蛋白表达水平的影响。4.对A549和H1299细胞进行不同处理,设立miR-34b-3p inhibitor组、miR-NC组、miR-NC+PL 10μmol/L组、miR-34b-3p inhibitor+PL 10μmol/L组,进行 CCK-8 及 Transwell 实验,检测下调 miR-34b-3p 表达对 PL 对 A549、H1299细胞增殖、侵袭效应的回复作用。5.构建无3’UTR区的TGFBR1表达载体,设立PL 0 μmol/L组、PL 10μmol/L组、PL 10 μmol/L+pcDNA3.1-TGFBR1 组,Western blot 检测 TGFBR1 蛋白水平,CCK-8及Transwell实验检测无3’UTR区的TGFBR1表达对PL对A549、H1299细胞增殖、侵袭的回复作用。6.收集转移非小细胞肺癌（TNM分期Ⅳ期）与非转移非小细胞肺癌（TNM分期Ⅱ期）两种临床标本,应用qRT-PCR测定两种标本miR-34b-3p表达水平。结果1.生物信息学软件预测TGFBR1与miR-34b-3p存在互补配对区域,可能为miR-34b-3p 的 靶基因。2.双荧光素酶报告基因实验证实miR-34b-3p可与TGFBR1的3’UTR结合,下调双报告基因载体中萤火虫荧光素酶活性（P＜0.05）。3.Western blot检测结果显示,上调miR-34b-3p表达可降低TGFBR1蛋白的表达水平（P＜0.05）;结合双报告基因实验结果,可得出TGFBR1是miR-34b-3p的靶基因。4.CCK-8 及 Transwell 实验结果显示,10 μmol/L PL 与 miR-34b-3p inhibitor 联合作用削弱了 PL对A549、H1299细胞增殖、侵袭的抑制作用（P＜0.05）。5.Western blot 结果显示,在 A549、H1299 细胞,与 PL 0 μmol/L 组相比,PL 10μmol/L单独处理后细胞的TGFBR1表达水平降低（P＜0.05）;PL 10μmol/L+pcDNA3.1-TGFBR1联合作用组TGFBR1蛋白表达几乎不受影响。CCK-8及Transwell实验结果显示,与PL 10 μmol/L组相比,PL 10μmol/L+pcDNA3.1-TGFBR1组对A549和H1299细胞的增殖、侵袭抑制作用较小（P＜0.05）。6.与非转移非小细胞肺癌标本相比,转移的非小细胞肺癌标本中miR-34b-3p表达较低（P＜0.05）。结论1.PL可以刺激多种非小细胞肺癌细胞miR-34b-3p过表达,并参与了多种非小细胞肺癌细胞的调控途径。2.本研究首次发现,PL可上调miR-34b-3p的表达,进而作用于TGFBR1的3’UTR区,负向调控TGFBR1的表达,调控非小细胞肺癌的增殖和侵袭。3.PL可以促进非小细胞肺癌A549和H1299细胞的凋亡。4.与非转移非小细胞肺癌标本相比,转移的非小细胞肺癌标本中miR-34b-3p表达较低,提示PL有可能作为转移的非小细胞肺癌治疗的联合药物。